ＳＲＡＰ分析體系的優化及在枇杷種質資源研究上的應用

摘要：以me7(5’-TGAGTCCAAACCGGTCC-3’)和em7(5’-GACTGCGTACGAATTCAA-3’)正反向引物組合對西班牙枇杷品種Javierin進行了SRAP分析體系的優化，結果表明，在25μL反應體系中，5種主要成分的適宜濃度或用量分別是：dNTPs 0.3 mmol/L，Mg²⁺+2，5 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.0 U，引物0.3μmol/L，模板DNA 20 ng，優化的擴增程序為：94℃預變性5 min。94℃變性l min，35℃復性1 min，72℃延伸1 min 30 s，5個循環；之后94℃變性1min，50℃復性1 min，72℃延伸1 min 30 s，35個循環；最后72℃下延伸10 min。并將該優化的體系在來自中國、西班牙、日本、意大利和美國的46份枇杷種質資源上進行了SRAP擴增的初步應用，經瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳均獲得了清晰、重復性好的SRAP指紋圖譜。

關鍵詞：枇杷；種質資源；SRAP；體系優化

中圖分類號：S667.3 文獻標識碼：A

文章編號：1009-9980(2008)03-348-05

SRAP即序列相關擴增多態性(sequencerelatedampli6ed polymorphism)，它是由美國加州大學蔬菜作物系Li等于2001年提出來的一種新型的基于PCR的標記系統。它針對基因的外顯子里GC含量豐富而啟動子和內含子里AT含量豐富的特點來設計引物進行擴增，因不同個體中的內含子、啟動子與間隔區長度不同而產生多態性。該方法具有操作簡便、中等產量、高共顯性、高重復性、易于進行條帶分離與測序等優點。而且該類標記在基因組中分布較均勻。適合進行基因定位、克隆、遺傳圖譜構建及遺傳多樣性分析等研究。由于SRAP引物設計的特殊性，可檢測基因的可讀框區域，因而體現的是物種間基因的多態性。檢測的結果更能反映物種的遺傳多樣性和親緣關系。目前SRAP已成功應用于柿、柑橘、香蕉、桃等果樹遺傳多樣性的研究。

我國有非常豐富的枇杷種質資源，有紅肉和白肉品種、品系或優良單株共計300多個，與此同時，我國也從日本、西班牙和美國等國家引進了超過10個優良品種，本試驗所選用的40多個品種來自國內外引進的主栽品種，具有廣泛代表性。我們先對枇杷SRAP體系進行了優化，在獲得了重復性和可靠性均良好的譜帶后，對來自國內外的46份枇杷種質資源進行了SRAP分析，為枇杷種質資源的分類和育種提供依據。

1 材料和方法

1．1 材料

試驗于2007年在華南農業大學園藝學院生物技術研究所進行，試材取自華南農業大學枇杷種質資源圃，46份種質來自6個國家(表1)，取1 a生枝條的嫩葉裝入自封塑料袋，清洗葉背茸毛及雜質后用吸水紙吸干備用。

1．2 方法

1．2．1 DNA提取基因組DNA的提取參照楊向

2 結果與分析

2．1 dNTPs濃度對SRAP擴增的影響

dNTPs是PCR反應中核苷酸的來源，其用量直接影響PCR擴增的產量，濃度過高會導致核苷酸的錯誤摻入，過低則會影響合成效率。從圖1擴增結果可見，0.1～0.4 mmol/L濃度的dNTPs均可擴增出條帶，但在0.1 mmol/L時擴增量不足，條帶不甚清晰，當濃度大于0.2 mmol/L時擴增條帶比較清晰穩定，并以0.3和0.4 mmol/L dNTPs擴增出的條帶最為清晰，因此本試驗確定0.3 mmol/L dNTPs為最佳濃度。

2．2 Mg²⁺濃度對SRAP擴增的影響

Mg²⁺濃度是擴增成敗的重要影響因素之一。tooDNA聚合酶需由Mg2~激活，同時Mg²⁺也影響模板與引物的解鏈溫度及引物的退火程度，尤其對PCR反應的特異性及擴增片段產率的影響較大。Mg²⁺濃度在1.5～3.0 mmol/L時都有擴增產物，但在2.0～3.0mmol/L時擴增條帶較為穩定和清晰(圖1)。因此，本試驗認為Mg²⁺濃度為2.0～3.0 mmol/L都可以滿足SRAP擴增的需要，經3次重復最后確定Mg²⁺2.5mmol/L為最適濃度。

2．3 Taq DNA聚合酶用量對SRAP擴增的影響

TOO酶用量是影響PCR反應的關鍵因子，酶的用量過大易產生非特異擴增產物：過小則降低擴增產物的合成效率，從而影響多態性的檢出率和擴增結果的重復性。本試驗中，Taq酶用量在0.8～1.4 U范圍內都可以擴增出條帶，0.8 U時擴增量不足，以1.0～1.4U Taq酶擴增的條帶相對清晰，因此，確定1.0 U的Taq酶用量為適宜。

2．4 引物濃度對SRAP擴增的影響

引物濃度不宜過高，否則會加劇非特異性擴增和錯配的發生；引物濃度不足則PCR的擴增效率低下，擴增產物的產量低。本試驗中采用的3個引物濃度都可以擴增出條帶，而且條帶均較清晰。且在0.3-0.4 Ixmol/L時弱帶也比較清晰。本試驗通過使用引物me7和em7引物組合進行3次重復擴增，最終確定引物濃度以0.3 μmol/L較好。

2．5 DNA模板質量濃度對SRAP擴增的影響

DNA模板用量是制約擴增產物得率和特異性的一個重要因子，模板量過低，分子碰撞的機率太低而導致無擴增產物或不穩定；過高則會增加非特異性產物的擴增。本試驗采用10～30 ng的模板量均能擴增出條帶，但30 ng時擴增偏強，20 ng獲得的條帶更容易辨認和讀帶。因此，本試驗確定20 ng的模板量最適宜SRAP擴增。

2．6 穩定性

在上述試驗的基礎上，本研究建立了枇杷SRAP的優化體系，即在25.0 μL的反應體積中，dNTPs濃度為0.3 mmol/L，Mg²⁺濃度為2.5 mmol/L，YaqDNA聚合酶用量為1.0 U，2個引物濃度均為0.15μmol/L，DNA模板用量為20 ng。經上述PCR程序擴增的產物在1.8％(m/v)的瓊脂糖凝膠電泳及EB染色能夠得到清晰的條帶。利用該體系對枇杷屬46份種質資源進行了擴增，經1.8％的瓊脂糖凝膠電泳得到了清晰且重復性好的擴增譜帶(圖2)，利用該體系在6％的聚丙烯酰胺凝膠上擴增，針對部分引物組合擴增片段比較密集的區域能得到較好分離(圖3)，說明該優化的SRAP反應體系穩定可靠適用于枇杷屬種質資源的分子標記分析。我們利用該優化反應體系對我國的枇杷種質資源以及引進的國外品種進行了親緣關系研究，聚類分析結果將另文報道。

3 討論

SRAP分析體系中適當的模板DNA濃度、Taq酶、dNTPs、Mg²⁺及引物濃度直接影響PCR擴增的結果，過高或過低都會影響SRAP的效果，因此。進行SRAP體系的優化是獲得較好研究結果的先決條件。

本試驗優化了適用于枇杷的SRAP分析體系，針對不同引物組合經瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，均獲得了清晰的電泳圖譜，瓊脂糖電泳操作簡便、省時，成本較低；而聚丙烯酰胺凝膠電泳對條帶的分辨率較高，尤其是小片段和較近的片段之間效果更好。如果能將這兩種電泳方法結合，揚長避短將能得到理想的實驗結果。在用聚丙烯酰胺檢測SRAP-PCR產物時，要根據片段大小選擇膠的濃度，4％的凝膠較6％的片段分散，且對于條帶范圍密集區更容易讀帶，所以對不同的引物組合要根據它的片段大小和疏密選擇凝膠及膠的濃度，以方便試驗統計和觀察。同時本試驗也驗證了瓊脂糖在SRAP分析中的有效性，否定了瓊脂糖不適合進行SRAP檢測的說法。與AFLP技術相比，SRAP方法省去了酶切、連接、預擴增等繁瑣的步驟，節約了費用和時間。SRAP多態性較高，是進行遺傳多樣性分析的一種非常有效的分子標記。

目前應用在枇杷上的分子標記有RAPD、ISSR、AFLP等，SRAP在枇杷上還是首例報道，本試驗旨在豐富枇杷的分子標記研究和遺傳多樣性分析。