廣西野生楊梅資源遺傳多樣性的ＩＳＳＲ分析

摘要：廣西楊梅資源十分豐富。為了準確了解和掌握廣西野生楊梅資源類型，利用ISSR技術對廣西野生楊梅資源的分類和遺傳多樣性進行了探討。從116條ISSR引物中篩選出12條引物，對40份楊梅樣品進行ISSR—PCR分析。結果顯示，共擴增出154條DNA條帶，其中多態(tài)性條帶113條，占73.38％，表明廣西楊梅資源遺傳多樣性非常豐富。用NTYS—PC2.1軟件進行UPGMA聚類分析，可將供試楊梅樣品分為4大類：它們分別代表楊梅、大葉青楊梅、毛楊梅、青楊梅，其中大葉青楊梅的形態(tài)分類和ISSR分子分類存在很大的差異。

關鍵詞：楊梅；遺傳多樣性；ISSR；廣西

中圖分類號：S667.6 文獻標識碼：A

文章編號：1009-9980(2008)03-353-05

全世界楊梅屬(Mrrico)植物有60多種，中國楊梅屬植物有6個種，即毛楊梅(M.esculenta Buch.-Ham.)、青楊梅(M.edenphora Hanee)、矮楊梅(M.nana Cheval)、楊梅(Myrica rubra.et Zucc.)、全緣葉楊梅(M.integrifolia Roxb)和大楊梅(M.ar-boresceus S.R.Liet X.L.Hu.Sp.nor)。我國常說的楊梅是指楊梅種，在我國主要分布于東徑103°以東和北緯31°以南地區(qū)，即東南沿海的浙江、江蘇、福建、廣東、江西、安徽、湖南、貴州等省，其中浙江省的栽培面積和產(chǎn)量最多。雖然廣西楊梅經(jīng)濟栽培不多。但多樣的生態(tài)環(huán)境造就了豐富的楊梅資源。據(jù)報道。廣西有楊梅、毛楊梅、青楊梅(包括1個變型：大葉青楊梅M.adenophorct Hanee f.major Wu)3個種1變型。

目前楊梅的分類主要采用形態(tài)學特性和園藝學性狀來進行鑒定。也有一些學者利用RAPD技術和ISSR—PCR技術鑒定楊梅栽培品種。但尚未見有利用分子生物學方法對楊梅野生資源進行研究的報道。我們對廣西野生楊梅資源進行了調(diào)查和收集，并根據(jù)其形態(tài)特征進行了初步的分類，利用ISSR—PCR技術對廣西野生楊梅資源的類型和遺傳多樣性進行了探討。

1 材料和方法

1．1 材料

試驗材料采自廣西南寧市的良慶區(qū)、邕寧區(qū)、興寧區(qū)、上林縣和馬山縣，北海市合浦縣，欽州市靈山縣，防城港市上思縣，玉林市容縣，桂林市臨桂縣、灌陽縣，河池市環(huán)江縣以及百色市凌云縣等13個縣(區(qū))，共計38份野生楊梅資源和東魁楊梅(M.rubracv.Dongkui)與荸薺楊梅(M.rubra cv.Poji)2個栽培品種，基本涵蓋了廣西地理分布的東南西北，供試材料的詳細情況見表1。

1．2 DNA的提取及ISSR-PCR反應

采用改良CTAB法提取楊梅基因組DNA。

引物選用哥倫比亞大學(University of BritishColumbia，Set No.9，No.801-900)公布的序列和邱英雄等、錢劍林等文章中的引物序列及自己設計的引物，共116條，由上海Sangon公司合成。用6個形態(tài)差異較大的MSl、MS3、HJI、SSl、LY、NN5楊梅DNA樣品為模板進行引物篩選，從116條引物中篩選出12條擴增條帶好、信號強、反應穩(wěn)定且多態(tài)性豐富的引物(表2)用于本試驗研究。經(jīng)過優(yōu)化，最佳反應體系(20 μL)為：10 mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，50

利用這12條引物，能將所有供試的楊梅種樣品分開，說明這些供試材料具有一定的遺傳差異，它們之間具有豐富的多樣性。如以相似系數(shù)0.78劃分，第Ⅰ組的楊梅種可以分成3個亞組，第Ⅰ亞組包括RXl、RX2、RX3，HPl、HP2、LSl、LS2、L53、SS2、SS3、NNl、NN2，樣品分別采自桂南的容縣、合浦、靈山、上思、邕寧等地，屬于桂南環(huán)北部灣一帶：第Ⅱ亞組包括SLl、SL2、MS1、MS2、MS3、MS4、LGl、LG3、LG4、LG5、GYl、GY2、GY3、LH1、LH2、NN3、NN4、NN5、樣品分別來自桂西南的上林、馬山、武鳴，桂北的臨桂、灌陽、龍勝等地；第Ⅲ亞組包括HJ2、HJ6、HJ7，樣品采自桂西北的環(huán)江縣。它們基本上是按一定的地理氣候特征進行聚類的。

從聚類圖來看。大葉青楊梅與青楊梅并未聚類在一起。而是與楊梅和毛楊梅關系較近，關于大葉青楊梅是青楊梅的一個變型值得進一步研究。

3 討論

本試驗利用12條ISSR引物對廣西楊梅資源進行多樣性研究，結果表明廣西楊梅的遺傳多樣性比較豐富。進行聚類分析發(fā)現(xiàn)，在相似系數(shù)為0.75時可將其分為4大組，能分別將形態(tài)學特征相似的樣品聚類在一起，這與楊梅屬種問的形態(tài)學分類結果大體一致。廣西植物研究所根據(jù)花期時間、花蕊形態(tài)、葉片形狀等形態(tài)學分類依據(jù)認為大葉青楊梅是青楊梅的一個變型。但本試驗利用ISSR-PCR技術從分子水平研究發(fā)現(xiàn)，大葉青楊梅與青楊梅并未聚類在一起，它們關系較遠，而大葉青楊梅與楊梅和毛楊梅關系較近，因此。有關大葉青楊梅的分類有待于進一步研究。

通過分子系統(tǒng)樹結合采樣地點分析，與文獻報道的廣西楊梅種類地理分布基本一致。楊梅種分布較廣，適應性較強；大葉青楊梅主要分布在氣候較冷。生長海拔較高的桂西北及桂北一帶；毛楊梅則適應于氣候相對炎熱的桂西山區(qū)；青楊梅主要分布在沿海地區(qū)，海拔較低，氣溫差異相對較小的環(huán)境。楊梅種按地理生長環(huán)境分成3個亞組，說明了地理隔閡對楊梅種的遺傳分化具有直接影響力。在第Ⅱ亞組中樣品來自南寧武鳴的東魁楊梅和荸薺楊梅是從桂林購買苗木在南寧進行種植的，桂林的東魁楊梅和荸薺楊梅又是從浙江引種的。由于桂北與浙江的氣候環(huán)境基本相同，同屬亞熱帶氣候，桂北有許多野生楊梅分布，在古代曾有楊梅種植，可能在古代浙江和桂北曾經(jīng)有過楊梅資源的交流，因而浙江的東魁楊梅和荸薺楊梅與桂北的楊梅品種聚類在一起。

4 結論

從116條ISSR引物中篩選出12條引物，對40份廣西楊梅資源進行ISSR-PCR分析，共擴增出154個DNA位點。其中113個為多態(tài)性位點，占總位點73.38％，從分子水平證實了廣西野生楊梅遺傳多樣性非常豐富。利用ISSR技術能很好鑒定楊梅屬的種和楊梅種的類型，廣西野生楊梅資源可分為4個種，對大葉青楊梅作為青楊梅的一個變型提出了異議。未篩選到能將楊梅按照顏色分類的ISSR引物。

致謝：對廣西農(nóng)業(yè)科學院作物遺傳改良生物技術重點實驗室提供的幫助深表謝意。