苯并噻二唑（ＢＴＨ）對蘋果抗斑點落葉病的誘導

摘要：對誘導劑苯并噻二唑(Benzothiadiazole，BTH)在不同質量濃度下對蘋果抗斑點落葉病的誘導作用，以及誘導抗性與木質素和富含羥脯氨酸糖蛋白(HRGP)含量的關系進行了研究。BTH誘導蘋果主枝頂梢，整株接菌后，采用病情指數統計發病程度。培養基測定抑菌活性；比色法測定蘋果受誘導后木質素和HRGP含量。結果表明，BTH能誘導蘋果產生系統獲得性抗性，當誘導質量濃度為150mg/L時，可使病情指數由對照的26.34下降到16.87，抗病持效期可達15 d，而BTH本身對蘋果斑點落葉病菌分生孢子萌發及菌絲生長無明顯影響。生理指標測定表明，木質素和富含羥脯氨酸糖蛋白(HRGP)含量增加，可能是抗病性增強的生理原因。

關鍵詞：蘋果斑點落葉病；苯并噻二唑；誘導抗病性；木質素；富含羥脯氨酸糖蛋白

中圖分類號：S661.1 文獻標識碼：A

文章編號：1009-9980(2008)03-362-05

蘋果斑點落葉病(Alternaira alternata f.mali)是近年來我國蘋果產區嚴重的病害之一，主要危害新梢嫩葉，導致果樹生長季早期落葉，嚴重影響果品質量和產量。該病由細鏈格孢(Alternaira alternata)的蘋果專化型(f.mali)病菌引起，病菌存在多種生理分化現象。長期以來對蘋果斑點落葉病主要采用化學防治的方法，由于殺菌劑的頻繁使用，常導致一些抗(耐)藥性菌株的出現，不僅增大了對病害防治的難度，而且造成農藥殘留和環境污染等問題。因此國際上正積極探討新的高效、無公害、無殘留的防治植物病害的途徑。

植物誘導抗病性具有抗病譜廣、持續時間較長的特點，更為重要的是目前發現大部分誘導劑對環境無污染，因而備受國內外的重視。苯并噻二唑(BTH)作為能激活植物一系列抗病防衛反應的誘導劑，已被國內外廣泛應用，在黃瓜、番茄、甜瓜、煙草、水稻以及禾谷類等作物上，文獻報道其對真菌病、細菌病和病毒病等均有一定的防效。BTH可誘導與植物抗病防御有關基因的表達以及抗病相關蛋白的產生，使植物產生系統獲得性抗性(systemic acquiredresistance，SAR)。

目前，BTH多在1 a生植物上應用。而在蘋果樹上的應用尚未見報道。我們主要研究BTH對蘋果樹抗斑點落葉病的誘導作用，并探討BTH誘導蘋果樹對斑點落葉病的抗性與木質素及富含羥脯氨酸糖蛋白(HRGP)含量的關系，為進一步研究BTH誘導蘋果樹產生抗病性的生理生化機制提供理論依據，同時也為防治蘋果斑點落葉病提供新的思路和方法。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 材料1 a生紅富士蘋果苗，由北京農學院科技產業集團提供，果苗長勢健壯一致，于2007年3月下旬栽種于盛有混合土(園土：肥料：沙土=2:1:1。并用0.3％的KMn04對混合土進行消毒)的盆中，于溫室內培養，試驗期間進行正常管理。

1．1．2 菌種蘋果斑點落葉病菌(Alternaira alterna-ta f.mali)經由田間自然發病植株分離純化，人工回接試驗證實后，于PDA培養基斜面保存備用。

1．1．3 藥劑 苯并噻二唑(Benzothiadiazole，BTH)由南開大學元素有機化學國家重點實驗室提供。羥脯氨酸、對二甲氨基苯甲醛、正丙醇等試劑由北京化學試劑公司提供。

1．1．4 測試儀器TU-1901 紫外可見分光光度計(北京普析通用)，LK-400型微電腦定時噴霧器(中國林業科學院林業技術公司)，無菌操作臺(蘇州凈化設備有限公司)，YXQ-LS-18SI自動手提式滅菌器(上海博迅實業有限公司)，MoticDM-BA300生物顯微鏡(北京麥克奧迪儀器儀表有限公司)，DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器等(鞏義市予華儀器有限責任公司)。

1．2 方法

1．2．1 誘導處理 用含BTH為100、150、200、250mg/L(各含體積分數0.05％Tween-20)的水溶液噴霧至果樹苗主枝頂梢(各處理枝條長度相近)，以霧滴布滿葉面但不下流為標準，對照樹苗噴施含0.05％Tween-20的水溶液。每株果苗上掛牌標記3個枝條(包括處理頂梢)，每枝條5片新葉，3 d后整株果樹接種病原菌。接種的孢子懸浮液濃度為16x10倍顯微鏡視野下60-70個，間隔噴霧保濕48 h。接菌10 d后統計標記葉片的病情指數。每處理10株果苗，3次重復。

1．2．2 抑菌活性測定 配制BTH終質量濃度為250、200、150、100 mg/L的PDA培養基平板。接種直徑為0.5 am病原菌片，以不加BTH為對照。26℃恒溫培養箱中培養。每處理10個PDA平板，重復3次。分別在接種后2、4、6 d觀察菌絲生長情況，并測定菌落直徑。

1．2．3 誘導持效期的測定 選用1.2.1篩選的適宜BTH噴施質量濃度(150 mg/L)處理供試果苗，對照樹苗噴施0.05％Tween-20水溶液。每株果苗上掛牌標記3個枝條，每枝5片新葉，分別在處理6 h、l、3、6、9、15 d后整株接種蘋果斑點落葉病菌，接菌10 d后統計標記葉片的病情指數。每處理10株果苗，3次重復。

1．2．4 病害調查 對照植株充分發病后，分別調查對照和處理的病情，記錄各級病葉數，計算病情指數及誘抗效果。蘋果斑點落葉病分級標準參考《植病研究法》的規定，病害嚴重度分為5級，標準為0級：無病斑；1級：病斑面積不超過葉面積1/10：2級：病斑面積占葉面積的1/10-1/4：3級：病斑面積占葉面積的1/4～1/2；4級：病斑面積占葉面積的1/2～3/4：5級：病斑面積占葉面積的3/4以上：

1．2．5 誘導后木質素和富含羥脯氨酸糖蛋白含量的測定用150 mg/L BTH處理供試果苗頂梢2個枝條，對照樹苗噴施0.05％Tween-20水溶液，于誘導后1、3、5、7、10、13、16 d時分別采集處理與未處理枝條的中部葉20片，每10株為1個處理，3次重復。測定其木質素含量和富含羥脯氨酸糖蛋白(HRGP)的含量(采用李建華等的方法進行)。每個指標重復測定3次。

2 結果與分析

2．1 不同質量濃度BTH誘導蘋果樹抗病效果

處理植株發病程度明顯低于對照植株，這表明BTH各處理均對蘋果樹有明顯的誘抗作用。其中以150 mg/L誘導效果最佳，與其它處理差異顯著，同時看出誘導效果隨BTH質量濃度的升高而呈先增強后降低的趨勢(表1)。試驗中發現250 mg/L的BTH施與葉面后，對葉片有輕微的影響，葉片表現色淺，無光澤、易早衰。

本試驗中篩選出BTH適宜質量濃度為150 mg/L。該處理可使蘋果的感病程度由對照病情指數26.34下降到16.87，減輕了病菌的危害，在生產上有一定的應用價值。此外，除100 mg/L外，其它處理中的處理枝條的病情指數均略高于未處理枝條，這說明BTH可能先使處理枝條產生過敏反應(HR)，進而誘導整個植株產生系統獲得性抗性(SAR)。

2．2 不同濃度BTH培養基抑菌活性

對培養基接種抑菌調查結果表明，供試的蘋果斑點落葉病菌生長良好，芽管和菌絲形態均與對照一致。對2、4和6 d的菌絲生長情況進行Tukey法多重差異比較，結果顯示，各濃度處理均與對照差異不顯著。表明誘導劑BTH在供試的質量濃度范圍內對蘋果斑點落葉病菌無明顯的抑菌活性。

2．3 BTh處理后蘋果樹抗性的變化情況

BTH誘導的抗性在處理后不同時間均有作用。誘導處理后間隔3.6，9 d接種的誘導效果分別高達53.13％，56.25％，46.88％。其中，處理后3～6 d接種產生最佳誘導效果。以后隨著間隔時間的延長，誘導效果逐漸下降，在處理后間隔15 d接種的誘導效果降低到28.12％，但抗病程度與對照相比仍差異顯著。由此可見，用BTH處理蘋果樹時。其誘導抗病性的持效期至少可達15 d。

2．4 BTH處理后蘋果樹苗木質素含量的變化

植物的木質素是由許多苯丙烷單體聚合在一起的交聯分子。其在細胞壁上經常和纖維素及其它糖類聯結在一起，沉積在壁上形成木栓化。阻止病原菌侵染和蔓延。

用BTH處理蘋果樹頂梢后，葉片木質素含量的變化趨勢見圖2。從圖2可以看出，BTH處理后蘋果葉片木質素含量在處理后16 d時與對照接近，而在其它取樣時間則明顯高于對照，證明BTH處理后可誘導蘋果抗病物質木質素的積累。整個處理過程中木質素含量呈先增后降趨勢，與2.3測定的誘抗持效期變化趨勢一致。說明木質素在蘋果抗病過程中有一定作用。此外。還可以發現處理3 d后頂梢以外枝條葉片的木質素沉積高于處理頂梢，7 d后2者無明顯差異。而對照整個過程中頂梢與其它邊枝葉片木質素含量無明顯差異，證明BTH可以由頂梢內吸傳導至樹體各部位，進而激活其它部位也產生抗病物質來抵制病菌的侵害。

2．5 BTH處理后蘋果樹苗HRGP含量的變化

細胞壁木質化是植物產生主動抗病性的主要機制之一。富含羥脯氨酸糖蛋白(hydroxyproline-richglycoprotein，HRGP)是植物細胞壁的主要結構蛋白，是細胞壁中木質素沉積的位點。細胞壁中HRGP的積累在植物的抗病中起著一定的作用，BTH處理能明顯影響蘋果樹體內HRGP的形成。

從圖3可以看出BTH處理后HRGP的變化趨勢基本與木質素的變化趨勢一致。但在整個取樣時期HRGP含量均高于對照，且在處理后7 d含量達到最高值。這可能說明HRGP在蘋果抗病反應中表現的更積極。同樣由圖3可以發現誘導5 d后處理頂梢以外枝條葉片HRGP的積累高于處理頂梢，13d后2者無明顯差異，而對照整個過程中頂梢與其它邊枝葉片HRGP含量無明顯差異。這也證明BTH可以由頂梢傳導至樹體各部位，進而激活其它部位產生抗性物質。

3 討論

系統獲得性抗性(SAR)是植物抗病性的一種重要表現形式。當前，人們正致力于將SAR誘導因子作為農藥的替代品應用于農作物的保護。從本試驗結果來看，設置的4個BTH處理濃度均對蘋果樹有明顯的誘導抗病作用。用BTH處理蘋果樹時，只處理了果樹的頂梢，而結果表明，整株果樹都對斑點落葉病菌產生了抗性，也就是說BTH可以通過內吸誘導蘋果樹整體產生系統獲得性抗性。這證明了BTH是一種有效的非生物型誘導劑。可顯著的誘導植物形成對病原菌的系統抗性。在適宜誘導質量濃度150 mg/L處理下，BTH處理3 d后就開始有比較明顯的誘導效果，生理機制上表現為抗病結構物質木質素和HRGP顯著增加，誘導抗性的持效期至少在15 d，這說明BTH在蘋果樹上的應用是可行的。

本試驗結果表明，BTH對斑點落葉病菌的孢子萌發和菌絲生長未呈現抑制作用。這與李玉紅和Nicole Benhamou等的研究結果一致。試驗結果還發現，高質量濃度的BTH容易對蘋果樹產生一定的藥害，葉片表現早衰，枝條節間縮短，葉片叢生，具體原因需進一步研究。

木質素作為植物細胞壁的基本組成成分之一，不僅對病原微生物的侵害起屏障作用，而且木質素低分子量酚類前體以及多聚作用時產生的游離基可以鈍化病原真菌的細胞。富含羥脯氨酸糖蛋白(HRGP)是植物細胞壁的主要結構蛋白，與木質素的形成密切相關。當植物受病原菌侵染或細胞壁受損時，HRGP會在植物體內大量積累以修復細胞壁的結構，進而增強抗病性。可見，木質素與HRGP含量是植物抗病中兩個重要的抗病指標。本研究結果表明BTH處理后可誘導果樹葉片HRGP的積累和木質素的增加，且2者在積累的時間進程上表現出較好的一致性，證實了BTH可誘導植物產生系統獲得性抗性(SAR)。

4 結論

BTH對蘋果抗斑點落葉病有顯著的誘導效果。適宜誘導質量濃度為150 mg/L，它可使蘋果樹的病情指數由對照的26.34下降到16.87，抗病持效期可達15 d。BTH本身對病菌分生孢子萌發及菌絲生長無明顯影響。其主要抗病機理是促進了木質素和富含羥脯氨酸糖蛋白(HRGP)含量的增加，從而誘導植物產生系統獲得性抗性。

致謝：中國葡萄協會晁無疾教授對本文提出了寶貴的指導與修改意見，在此深表感謝。