熱水噴淋處理結合拮抗酵母菌對櫻桃果實采后腐爛及品質的影響

摘要：采用60℃20 s熱水噴淋處理(HWRB)、拮抗菌(羅倫隱球酵母)浸泡處理(10⁸個細胞/mL的孢子懸浮液)及2者結合處理先鋒櫻桃果實，研究各處理對果實常溫貯藏5 d后的自然發病率、腐爛指數和感官品質及對接種擴展青霉或灰葡萄孢霉后果實傷口的發病率和病斑直徑的影響。結果表明，HWRB處理能顯著抑制果實的自然發病率及腐爛程度，拮抗菌的效果次之，而結合處理的抑制效果最好；各處理均未影響果實的品質。對接種擴展青霉的果實，結合處理能夠有效減少傷口94％的腐爛和病斑直徑的擴大，且效果好于HWRB及拮抗菌單獨處理：對接種灰葡萄孢霉的果實，拮抗菌能夠顯著抑制傷口的發病率和病斑直徑，而HWRB處理則能完全抑制傷口的發病，結合處理并未帶來更好的效果。總之，HWRB處理結合拮抗菌能夠成為一種理想的控制櫻桃果實采后腐爛的處理方法。

關鍵詞：櫻桃果實；熱水噴淋處理；拮抗酵母菌；腐爛；品質

中圖分類號：S662.5 文獻標識碼：A

文章編號：1009-9980(2008)03-367-06

甜櫻桃為薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus L.)櫻亞屬(cerasus Pers.)植物，主要分布于山東煙臺和遼寧大連一帶，是落葉果樹中成熟最早的樹種之一，一般成熟于夏季的5、6月份，有“春果第一枝”的美稱。甜櫻桃果肉柔軟多汁，果實采后在常溫下容易腐爛變質，果梗枯萎變褐，色澤變暗，果肉軟化，以至霉爛，雖是核果類果實卻具漿果類的一些特性，且甜櫻桃成熟正值夏季來臨，易受損傷，故極不耐貯運。因此，采后處理保鮮對該果實的加工銷售至關重要。過去常用的化學殺菌劑由于對食品和環境產生不良影響。其使用受到越來越多的限制，因此繼續尋找可替代的無毒無殘留的處理方法成為當今的研究熱點。

采后熱處理作為一種非化學處理方式已被廣泛用于果蔬貯藏保鮮中，以控制病蟲害，改變對逆境的反應，保持水果品質。熱水噴淋處理(Hot WaterRinsing and Brushing。HWRB)作為一種新的熱處理方式，由于其短時高溫的處理特點受到越來越多的關注。該處理不僅能夠清除果蔬表面的泥土、農藥和真菌孢子，而且能夠殺死果蔬表面的大量微生物，改善果蔬外觀并保持其品質；同時與其它熱處理方式相比，該熱處理方式更有利于商業生產實際應用，并且已經被設計成為果蔬分級包裝生產線上的一部分，實現了對甜椒、市亡果等進行采后防腐保鮮處理。

生物防治劑作為替代化學殺菌劑的采后防治方法在控制果蔬采后腐爛的應用上顯示出較大的應用潛力。其中，羅倫隱球酵母(C.laurentii)已被用于控制蘋果和梨的青霉病和灰霉病病害。及草莓、獼猴桃和西柚等水果的生物防治中。拮抗菌作為一種非化學的生物防治方法，能夠通過或與病原菌競爭營養和生存空間，或產生孢外水解酶參與寄主真菌細胞壁的降解，或誘導寄主產生抗病性來起到生防效力。

雖然已有報道證明HWRB處理或拮抗酵母單獨處理均能減少果蔬采后的腐爛，但他們各自都有一定的缺陷，從而無法完全控制采后病害。對于尋求替代化學殺菌劑來控制腐爛的需要促使各種研究致力于將各種非化學的處理方法結合起來以達到與殺菌劑相同的作用效果。理想的處理方式能夠處理所遇到的所有致病菌，并保護果實不遭遇處理后的再次感染。目前，熱處理結合拮抗菌處理已成功用于蘋果、桃及油桃和草莓的采后處理中，均能夠有效控制果實的自然腐爛和由青霉、灰霉及果生鏈核盤菌等所導致的病害。但是關于HWRB處理結合拮抗菌來防治櫻桃果實采后腐爛的研究還未見報道，所以我們的目的就是考察HWRB處理結合拮抗酵母菌對控制櫻桃果實采后自然腐爛及對接種青霉和灰霉后的控制效果。以及對果實貯藏品質的影響，以探討該處理的應用價值，為其實現商業操作提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1．1 材料

供試櫻桃果實先鋒(P.avium L.cv.Van)于2007年6月5日采自山東煙臺蓬萊諸由觀鎮楊莊村。果實于7成熟時采收，色澤相近，大小一致，無機械損傷或自然病害。采后立即裝箱并連夜運至南京農業大學實驗室，分組編號后置于0℃條件下貯藏待用。

擴展青霉(Penicillium expansum)購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。灰葡萄孢霉(Botrytiscinerea)由南京農業大學植物病理學實驗室提供。參照Karabulut等的方法，分別將2種真菌轉接到PDA培養基上，20℃下分別培養10 d和20 d后，用含0.03％Tween-20的無菌水沖洗菌落中的分生孢子。振蕩均勻后用血球計數板將孢子懸浮液濃度調整至105個孢子/mL。以備接種之用。

酵母拮抗菌羅倫隱球酵母(C.1aurentii)購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。參照Karabulut等的方法，將一環酵母菌菌落接種在20 mL NYDB培養液(8 g牛肉醬、5 g酵母浸粉、10 g葡萄糖、1L水)上，24℃下振蕩培養48 h后，振蕩均勻并用血球計數板將孢子懸浮液濃度調整至10s個細胞/mL，以備接種之用。

1．2 試驗分組及處理

1．2．1 自然腐爛及品質測定部分 自然腐爛每組30個果實。品質測定每組15個果實，均重復3次。對照組(CK)：不做任何采后處理的果實；HWRB處理組(H)：參照Fallikt21的方法對櫻桃果實進行60℃20 s熱水噴淋處理(該處理條件由前期試驗確定)，然后立刻強制通風以冷卻晾干；拮抗菌處理組(Y)：將櫻桃果實浸于酵母菌孢子懸浮液中(10⁸個細胞/mL)約2 min，然后立刻強制通風以冷卻晾干；HWRB處理+拮抗菌結合處理組(H+Y)：首先將果實進行60℃20 s熱水噴淋處理。冷卻晾干后再浸于酵母菌孢子懸浮液中(10⁸個細胞/mL)約2 min，取出后強制通風以冷卻晾干。將處理后的各組果實置于(20±1)℃，RH(90+5)％的環境下模擬貨架條件貯藏5 d。統計腐爛情況及測定品質指標。

1．2．2人 人工接種部分 參照Karabulut等的方法，先用2％NaOCl溶液將櫻桃果實表面消毒約2 min，然后用清水沖洗干凈并晾干備用。用直徑3 mm的消毒釘子在果實表面赤道部位刺一個3 mm深、3 mm寬的傷口，然后在傷口處分別接種20μL 10⁵個孢子/mL的青霉或灰霉的孢子懸浮液。然后晾干備用。對照組(CK)：接種青霉或灰霉孢子懸浮液于果實；HWRB處理組(H)：將接種了青霉或灰霉孢子懸浮液的果實進行60℃20 s熱水噴淋處理。然后立刻強制通風以冷卻晾干；拮抗菌處理組(Y)：將接種了青霉或灰霉孢子懸浮液的果實浸于酵母菌孢子懸浮液中(10⁸個細胞/mL)約2 min，然后立刻強制通風以冷卻晾干；HWRB處理+拮抗菌結合處理組(H+Y)：首先將接種了青霉或灰霉孢子懸浮液的果實進行60℃20 s熱水噴淋處理，冷卻晾干后再浸于酵母菌孢子懸浮液中(10⁸個細胞/mL)約2min，取出后強制通風以冷卻晾干。每組30個果實，重復3次。將處理后的各組果實置于(20±1)℃，RH(90±5)％的環境下貯藏3 d，統計傷口處發病率和病斑直徑。

1．3 測定項目與方法

1．3．1 失重率 采用稱重法測定。

1．3．2 硬度 參照Muskovics等的方法，將果實置于TA.XT2i質構儀(英國Stable Micro Systems)P/50探頭下，測定果實的硬度。試驗參數設置為：探頭預壓速度5 mm/s，測試速度0，1 mm/s。探頭下壓距離5 mm，以N/mm計。

1．3．3 可溶性固形物(SSC)與可滴定酸(TA)含量WYT-4型手持糖量儀測定SSC，GBl2293-90電位滴定法測定TA。

1．3．4 果實自然發病率的測定發病率(％)=腐爛果數/總果數×100。

1．3．5 果實腐爛指數的測定參照Fallik等的方法并略作改動。將果面的腐爛程度分為5級-0級：無腐爛；1級：果面出現1～3個小爛斑：2級：果面腐爛面積在1/4～1/2之間；3級：果面腐爛面積在1/2～3/4之間：4級：果面腐爛面積>3/4。然后按下面的公式計算腐爛指數：腐爛指數=[∑(級數×對應腐爛果數量)]/該組果實總數。

1．3．6 果實傷口發病率測定 用已發生腐爛的傷口數占總傷口數的百分比來表示。

1．3．7 果實傷口病斑直徑測定 十字法測定果實傷口處的寬度及長度，并求2者均值表示，以cm計。

1．4 數據處理

采用SAS8.2分析系統軟件進行方差分析(ANOVA)和鄧肯氏多重比較法(Duncan’s MultipleRange Test)在P=0.05的水平下進行檢驗。

2 結果與分析

2．1 HWRB結合拮抗酵母菌處理對櫻桃果實自然發病率和腐爛指數的影響

本試驗通過測定櫻桃果實的自然發病率和腐爛指數來反映HWRB處理結合接種拮抗酵母菌(C.laurentii)與單獨處理的效果。由圖1所示，對照組果實在常溫貯藏5 d后的發病率為8.33％，拮抗菌處理組的略低，為7.87％，而HWRB單獨處理組也有4.70％的果實發生腐爛，結合處理則顯著降低了果實的發病率(P<0.05)，僅為1.77％；對于腐爛指數也有相似的結果，處理組的腐爛程度均顯著小于對照(P<0.05)，其中HWRB單獨處理的效果與拮抗菌無顯著差異(P>0.05)，分別為0.38和0.46，而結合處理組果實的腐爛指數為0.10，可見結合處理能夠有效控制櫻桃果實在常溫貯藏下的腐爛。

2．2 HWRB結合拮抗酵母菌處理對櫻桃果實貯藏品質的影響

由表1所示。HWRB或拮抗菌單獨處理及2者結合處理均未顯著影響櫻桃果實經常溫貯藏5 d后的各項品質指標。其中，結合處理組果實的失重率略低于對照及單獨處理組：而HWRB單獨處理組及結合處理組果實的硬度較高：對于可溶性固形物和可滴定酸含量則各組間差異不顯著(P>0.05)；總體上，各處理均未影響櫻桃果實的食用品質。

2．3 HWRB結合拮抗酵母菌處理對人工接種擴展青霉和灰葡萄孢霉后傷口發病率和病斑直徑的影響

評價HWRB處理結合接種拮抗酵母菌(C.laurentii)對接種青霉或灰霉后傷口的影響是通過對衡量其發病率和病斑直徑進行的。由圖2所示，

3 討論

本試驗結論表明，60℃20 s HWRB處理能夠顯著降低櫻桃果實在常溫下的自然發病率和腐爛程度，并能達到商業可接受的水平(P<5％)，同時該處理能夠殺死果實表面的大量致病菌(數據未列出)；許多學者的研究都證明了HWRB處理是通過減少果實表面的寄生微生物數量(一般為3～4個數量級)從而顯著降低了果實的發病率；另外，60℃20 sHWRB處理對主要致病菌青霉和灰霉，尤其是對后者有很強的殺死作用，減少了傷口的感染并控制了病斑直徑的擴大。

研究發現熱處理也能夠作為一種熱脅迫或逆境來誘導或增強果實的抗病性，但大量結論證明了只有在果實被病原菌侵染或刺傷后再進行熱處理才能誘導大量植保素的合成，同時熱處理對病原菌孢子的“熱休克”效應推遲了它的萌發，從而為被侵染果實建立抵御病原菌的抗性機制爭取了時間。當處理后的果實進入到貯藏期時，會遭遇可能的環境中微生物的再次侵染，而果實已建立的抗性可能不足以抵御它所導致的腐爛，即熱處理無法提供后續的保護效應：而較熱處理的致死效果而言，拮抗菌缺乏對病原菌的有效根除，且不同種類的拮抗菌，其作用效果不同，不能同時對幾類致病菌均產生控制作用：更為關鍵的是拮抗菌的成功定植取決于它與病原菌哪一方能更早的寄主于果實或其傷口處并大量繁殖，因為有些病原菌在采前即已潛伏侵染，此時生物拮抗劑對已被病原菌侵染的果實已無能為力，所以有人認為拮抗菌更適合采前的田間被施用；本試驗中，人工接種拮抗酵母未能有效抑制傷口處青霉所導致的發病率，這與Qin等的結論不太一致，可能與果實種類不同有關，但該結論仍需進一步論證：然而拮抗酵母能夠顯著減少病斑直徑的擴展；并且拮抗酵母對傷口處灰霉所致的發病率和病斑直徑均能顯著抑制，這與Qin等的結論一致。

由于熱處理與生物防治2種處理方式各有優缺點，現在的研究熱點已轉移至將2者結合處理。本研究首次將熱水噴淋處理結合拮抗酵母菌(C.laurert-tii)處理應用于櫻桃果實的采后處理保鮮中。結果表明，結合處理無論是對果實在常溫貯藏條件下的自然發病率還是接種致病菌后傷口處的發病率及病斑直徑，均有顯著的抑制效果(P<0.05)，這與已有的關于結合處理的報道結論是一致的。這說明結合處理產生了協同效應：HWRB處理清除了果實表面的大量微生物，從而使拮抗菌更易于迅速大量的定植，這又為果實在貯期內可能遭遇再次侵染提供了防御屏障。在有效控制果實腐爛的同時，結合處理并未影響櫻桃果實的感官品質(表1)，單獨或結合處理與對照之間的差異不明顯(P>0.05)，這與Zhang等將熱水浸泡結合拮抗酵母菌處理草莓后常溫貯藏的結果一致。總體上講，結合處理能夠有效控制櫻桃果實采后腐爛的發生，今后仍需進一步研究其作用機理，為這種結合處理的實際應用提供支持。

4 結論

60℃20 s HWRB或拮抗酵母菌單獨處理能夠顯著降低櫻桃果實在常溫下腐爛的發生；并且60℃20 s HWRB單獨處理對主要致病菌青霉和灰霉，尤其是對后者有很強的殺死作用，減少了傷口的感染并控制了病斑直徑的擴大。而拮抗酵母菌單獨處理也對接種灰霉后傷口處的發病率和病斑直徑均能顯著抑制。但是，結合處理的效果最好，無論是對果實的自然發病率，還是接種致病菌后傷口處的發病率及病斑直徑。均有顯著的抑制效果，并且沒有顯著影響果實的感官品質。