全基因組基因表達(dá)分析技術(shù)及其在果樹上的應(yīng)用

摘要：基因表達(dá)分析對于揭示基因功能、了解基因間相互關(guān)系、闡明植物生長發(fā)育過程中的生理生化調(diào)控機(jī)制起著至關(guān)重要的作用。綜述了mRNA差異顯示、cDNA—AFLP、基因芯片、EST數(shù)據(jù)分析、基因表達(dá)系列分析(SAGE)等全基因組基因表達(dá)分析技術(shù)的原理特點(diǎn)及在果樹上的應(yīng)用情況，并介紹了利用全基因組基因表達(dá)分析技術(shù)開展果樹研究的思路。

關(guān)鍵詞：果樹；基因表達(dá)；基因芯片；表達(dá)序列標(biāo)簽；基因表達(dá)系列分析

中圖分類號：S66 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1009-9980(2008)03-382-07

高等生物基因組中多數(shù)基因在表達(dá)上具有時(shí)空特異性。基因表達(dá)分析對于揭示基因功能、了解基因間相互關(guān)系、闡明植物生長發(fā)育過程中的生理生化調(diào)控機(jī)制起著至關(guān)重要的作用。傳統(tǒng)的基因表達(dá)分析技術(shù)是Northera印跡雜交，通過雜交信號的強(qiáng)弱直接反映出基因表達(dá)的強(qiáng)度。結(jié)果直觀且非常可靠，但是一次雜交實(shí)驗(yàn)只能鑒定一個(gè)基因的表達(dá)情況，且靈敏度也不是非常高。隨著聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)的普及，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerasechain reaction.RT-PCR)技術(shù)成為單個(gè)基因表達(dá)分析的首選方法。與Northern印跡雜交相比，RT-PCR具有操作簡單、快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，而且采用多重RT-PCR技術(shù)還可以同時(shí)分析幾個(gè)基因的表達(dá)情況，此外，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR(real-time quantitative RT-PCR)還可以估算出基因的轉(zhuǎn)錄本數(shù)目，能夠?qū)虻谋磉_(dá)進(jìn)行精確的定量分析，所以，實(shí)時(shí)定量RT-PCR已成為單個(gè)基因表達(dá)分析的主要方法。

生物體內(nèi)的反應(yīng)呈網(wǎng)絡(luò)狀，隨著基因芯片(genechip)、基因表達(dá)系列分析(serial analysis of gene ex-pression，SAGE)、大規(guī)模平行信號測序(massively par-allel signature sequencing，MPSS)等技術(shù)的出現(xiàn)及GenBank中表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag，EST)數(shù)據(jù)量飛速增長，人們能夠同時(shí)監(jiān)測全基因組的基因表達(dá)信息。目前，擬南芥的基因表達(dá)分析研究已經(jīng)非常系統(tǒng)和深入。這為非模式植物的基因表達(dá)分析提供了良好的借鑒。作者簡單介紹mRNA差異顯示、cDNA-AFLP、基因芯片、EST數(shù)據(jù)分析、SAGE等全基因組基因表達(dá)分析技術(shù)的原理特點(diǎn)及在果樹上應(yīng)用情況，為科研人員開展果樹基因表達(dá)研究提供借鑒。

1 mRNA差異顯示的原理及其在果樹上的應(yīng)用

1992年，Liang等在RAPD-PCR和RT-PCR技術(shù)基礎(chǔ)上建立了mRNA差異顯示(mRNA differ-ential display)技術(shù)，也稱作差異顯示RT-PCR(Dif-ferential display RT-PCR，DDRT-PCR)技術(shù)。該技術(shù)是根據(jù)絕大多數(shù)真核生物mRNA具有多聚腺苷酸(polyA)尾結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，利用含oligo(dT)的3’一錨定引物(TuMNM為A、C或G，N為A、C、G或T)和5’端的隨機(jī)引物(長度10 nt)對mRNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。12個(gè)3’端錨定引物與20個(gè)5’端隨機(jī)引物組合形成的240對引物大約能擴(kuò)增產(chǎn)生2萬條DNA譜帶，其中每一條譜帶都代表一種特定的mRNA，大體涵蓋了在一定發(fā)育階段某種細(xì)胞類型中所表達(dá)的全部mRNA。將差別表達(dá)條帶中的DNA回收和鑒定，可以獲得差異表達(dá)基因的片段。

與差別雜交(differential hybridization)和差減雜交(subtractive hybridization)等技術(shù)相比，mRNA差異技術(shù)顯示具有簡便、靈敏、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，因此該技術(shù)發(fā)明后很快得到廣泛應(yīng)用，成為真核生物基因表達(dá)分析一種重要的技術(shù)手段。但是mRNA差異顯示技術(shù)也存在一些不足，主要是由于PCR反應(yīng)條件不夠嚴(yán)謹(jǐn)導(dǎo)致假陽性率高，且有時(shí)擴(kuò)增譜帶的強(qiáng)度與基因的表達(dá)水平并不相關(guān)，再有，mRNA差異顯示主要展示的是基因表達(dá)模式，不能提供全面的表達(dá)分布圖。

mRNA差異顯示技術(shù)已被應(yīng)用到多種果樹的基因表達(dá)研究中，如Lang等利用mRNA差異顯示技術(shù)從柑橘中鑒定出8個(gè)在葉片中表達(dá)的冷適應(yīng)基因；Thomas等利用該技術(shù)研究葡萄試管苗瓶內(nèi)生根與瓶外生根在基因表達(dá)上的差異，結(jié)果表明2種環(huán)境條件下葡萄苗的基因表達(dá)模式是一致的。

2 cDNA—AFLP的原理及其在果樹上的應(yīng)用

2．1 cDNA-AFLP的技術(shù)原理和特點(diǎn)

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Amplified fragment lengthpolymorphism，AFLP)是20世紀(jì)90年代初創(chuàng)立的分子標(biāo)記技術(shù)，是RFLP與RAPD相結(jié)合的產(chǎn)物，以擴(kuò)增片段的長度來展示限制性內(nèi)切酶酶切片段的長度多態(tài)性。AFLP是以基因組DNA為研究對象的，1996年Bachem等將反轉(zhuǎn)錄和AFLP結(jié)合在一起，創(chuàng)立了以mRNA反轉(zhuǎn)錄成的互補(bǔ)DNA(complemen，tary DNA，eDNA)為研究對象的AFLP分析技術(shù)——cDNA-AFLP。與mRNA差異顯示技術(shù)相比，cDNA-AFLP在基因表達(dá)分析上具有重復(fù)性好、假陽性率低、可檢測低豐度表達(dá)的基因、準(zhǔn)確反映基因間表達(dá)量的差別等優(yōu)點(diǎn)，與基因芯片技術(shù)相比，cDNA-AFLP具有無需預(yù)先知道基因序列信息的優(yōu)點(diǎn)，因此cDNA-AFLP技術(shù)是基因表達(dá)研究的有效工具。

2．2 cDNA-AFLP技術(shù)在果樹上的應(yīng)用

cDNA-AFLP技術(shù)已在諸多生物上得到廣泛應(yīng)用，近幾年來，已有一些利用cDNA-AFLP技術(shù)進(jìn)行果樹全基因組基因表達(dá)分析和基因克隆的報(bào)道。Geuna等利用cDNA-AFLP技術(shù)分析杏(Prunus ar-meniaca L.)果實(shí)發(fā)育及成熟過程中基因表達(dá)的差異，利用34個(gè)不同的引物組合在6個(gè)發(fā)育階段中共篩選出265個(gè)不同的cDNA-AFLP譜帶，對其中125個(gè)譜帶進(jìn)行克隆、測序分析，發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)的基因與細(xì)胞壁、糖、脂類物質(zhì)、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)代謝及激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，其中41％的差異表達(dá)基因與激素信號及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。Jensen等以蘋果砧木M.7 EMLA(半矮化砧木、可減少接穗品種對火疫病的敏感性)和M.9 T337(矮化砧木，不改變接穗品種對火疫病的敏感性)為試材，利用cDNA-AFLP技術(shù)研究砧木對接穗基因表達(dá)的影響，表明嫁接在M.9T337上的嘎拉蘋果的莖尖組織中光合作用相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄/翻譯相關(guān)基因、細(xì)胞分裂相關(guān)基因高度表達(dá)，與其相反，嫁接在M.7 EMLA上的嘎拉蘋果高度表達(dá)與脅迫有關(guān)的基因。利用cDNA-AFLP技術(shù)可以揭示植物感病前后基因表達(dá)的變化，闡明抗病品種的抗病機(jī)理和尋找抗病基因，例如，Schurdi—Levraud Escalettes等利用eDNA-AFLP技術(shù)探索對李痘病毒(Plumpox virus，PPV)具有部分抗性的杏品種Goldrieh在接種PPV前后基因表達(dá)的變化，表明感染PPV后，Goldrich的基因表達(dá)模式發(fā)生了改變，鑒定出21個(gè)與數(shù)據(jù)庫中基因有同源關(guān)系的差異表達(dá)的基因，它們分別與代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、防衛(wèi)、脅迫及胞內(nèi)/胞外連接有關(guān)。在此基礎(chǔ)上，他們利用RT-PCR技術(shù)和Northern印跡雜交技術(shù)檢測這些基因在Goldrich和一個(gè)感病試材(該試材與Goldrich有親緣關(guān)系)上表達(dá)的差異，表明編碼Ⅲ型幾丁質(zhì)酶、轉(zhuǎn)羥乙醛酶、驅(qū)動(dòng)蛋白(kinesin)和細(xì)胞骨架錨蛋白(ankyrin)的基因可能與杏對PPV的抗性有關(guān)。

3 基因芯片的原理及其在果樹上的應(yīng)用

3．1 基因芯片的技術(shù)原理和特點(diǎn)

基因芯片，也稱作DNA芯片(DNA chip)或DNA微陣列(DNA mieroarray)，是指高密度固定于固相支持物表面的單鏈DNA的微點(diǎn)陣。基因芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代中期隨著人類基因組計(jì)劃的發(fā)展而興起的一種新型的分子生物學(xué)技術(shù)，也是近年來生命科學(xué)與微電子學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)交叉、滲透發(fā)展起來的一門高新技術(shù)。基因芯片技術(shù)實(shí)際上是一種大規(guī)模集成的固相雜交技術(shù)。該技術(shù)的基本思想在于將已知的DNA序列作為探針，通過原位合成或顯微打印的方式將探針固化于支持物表面，然后將標(biāo)記的RNA或DNA樣品與探針DNA進(jìn)行雜交，通過激光掃描裝置或熒光檢測儀來檢測芯片表面的熒光信號，從而定量或定性地分析雜交模式。在傳統(tǒng)的Southern雜交和Northern雜交中，探針是游離在雜交液中，一次只能使用一種探針，與其相反的是，基因芯片是將探針固化在支持物上，在1 cm²的芯片上可以同時(shí)固化成千上萬個(gè)探針，因此具有高通量的優(yōu)點(diǎn)，此外，基因芯片還具有操作簡單、速度快(一般可在幾十分鐘內(nèi)完成)、自動(dòng)化程度高、結(jié)果客觀等突出優(yōu)點(diǎn)。

根據(jù)探針在固體支持物上的密度，基因芯片可以分為Microarray和Macroarray，其中Microarray應(yīng)用較多。Microarray多指點(diǎn)陣密度很高的基因芯片，通常以載玻片(2.2 cm×7.5 cm)為固體支持物，而Macroarray則指點(diǎn)陣密度較低的基因芯片，是以尼龍膜為支持物。大小一般為8 cm×l2 cm。根據(jù)探針的性質(zhì)，基因芯片可以分為短寡聚核苷酸芯片、長寡聚核苷酸芯片和cDNA芯片。

3．2 基因芯片技術(shù)在果樹上的應(yīng)用

利用基因芯片技術(shù)可以同時(shí)監(jiān)測細(xì)胞中成千上萬種mRNA的轉(zhuǎn)錄情況。而且快速、敏感、自動(dòng)化程度高，因此，基因芯片技術(shù)是分析高等生物全基因組基因表達(dá)的強(qiáng)有力工具。從2000年Aharoni等在《Plant Cell》上發(fā)表第1篇關(guān)于草莓基因芯片的報(bào)道至今，基因芯片技術(shù)在果樹上的應(yīng)用集中在蘋果、葡萄、柑橘、桃、香蕉、草莓等果實(shí)研究上。Aharoni等的研究小組將分離自成熟草莓果實(shí)的1701個(gè)cDNA克隆制備成基因芯片，然后對草莓花托和瘦果中的基因表達(dá)情況進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)259個(gè)cDNA克隆在瘦果中強(qiáng)烈表達(dá)，182個(gè)cDNA克隆在花托中強(qiáng)烈表達(dá)，其中66個(gè)克隆在瘦果特異表達(dá)，80個(gè)克隆在花托中特異表達(dá)。Lee等以富士蘋果為試材，利用構(gòu)建的cDNA基因芯片研究了蘋果幼果發(fā)育期基因的表達(dá)，對3 484個(gè)cDNA在幼果和成熟果中表達(dá)的分析表明，有12.8％的cDNA在幼果中表達(dá)的強(qiáng)度是成熟果中的2倍以上，而4.3％的cDNA在幼果中表達(dá)強(qiáng)度是成熟果中的8倍以上。Waters等將從葡萄漿果cDNA文庫中擴(kuò)增得到的4 608個(gè)cDNA克隆制備成基因芯片，然后分別對花期、花后2、5、8、10、12、13周的葡萄的基因表達(dá)進(jìn)行全面比較分析，發(fā)現(xiàn)葡萄漿果中表達(dá)的基因可分為4套(set)：第1套基因在花期強(qiáng)烈表達(dá)，花后表達(dá)穩(wěn)定下降。這一套基因主要是與光合作用有關(guān)的基因；第2套基因是與類黃酮合成有關(guān)的基因，這類基因在花后2周表達(dá)達(dá)到頂峰；第3套基因主要是編碼細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白的基因，在花后5周表達(dá)最強(qiáng)烈；第4套基因在漿果迅速膨大期開始強(qiáng)烈表達(dá)，這套基因主要與漿果成熟有關(guān)，基因的范圍較廣，很多基因的功能尚不知曉。Fonseca等在將來自西洋梨果實(shí)cDNA文庫和差減文庫(subtractive library)的1 364個(gè)cDNA克隆制備成基因芯片的基礎(chǔ)上，對梨果實(shí)發(fā)育和衰老過程中基因表達(dá)情況進(jìn)行分析，表明激酶和磷酸酶基因在梨果實(shí)發(fā)育早期被特異誘導(dǎo)，而與細(xì)胞壁修飾、色素合成、香氣合成有關(guān)的基因在果實(shí)成熟躍變期被激活。中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室金志強(qiáng)領(lǐng)導(dǎo)的研究小組把通過抑制差減雜交(suppression subtractive hy—bridization.SSH)篩選出的在香蕉果實(shí)中特異表達(dá)的265個(gè)cDNA克隆制備成cDNA芯片，然后對采后0 d和采后2 d的香蕉的基因表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)26個(gè)cDNA在采后2 d的香蕉果實(shí)中是上調(diào)表達(dá)的(up-regulated)。

4 EST分析技術(shù)的原理及其在果樹上的應(yīng)用

4．1 EST的概念及EST數(shù)據(jù)分析方法

EST是從cDNA文庫中隨機(jī)挑取單克隆，對其一端或兩端進(jìn)行測序后獲得的200-500 bp的DNA序列。EST來源于生物樣本的mRNA，代表生物體某種組織某一時(shí)期的特異表達(dá)基因，反映基因及基因表達(dá)水平與生長發(fā)育、繁殖分化、衰老死亡等一系列生命過程的關(guān)系。多個(gè)國家的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了大量的各種文庫的cDNA克隆測序工作，并且將所得到的cDNA序列提交到GenBank，形成EST數(shù)據(jù)庫－dbEST(http：//www.nebi.nlm.nih.gov/dbEST/index.html)。在過去的幾年里，dbEST數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)量在飛速增長。截至2007年12月14日，該數(shù)據(jù)庫中已有l(wèi) 360多個(gè)物種的48 164 566條EST序列。除了dbEST數(shù)據(jù)庫外，還有TIGR的Gene Indices、SANBI的STACKdb等數(shù)據(jù)庫。EST數(shù)據(jù)庫科學(xué)的收集整理方式和方便快捷的檢索途徑為廣大研究者提供了巨大便利。

EST數(shù)據(jù)分析包括序列前處理、聚類和拼接、基因注釋及功能分類、后續(xù)分析等步驟。序列前處理主要去除低質(zhì)量序列、載體序列、重復(fù)序列、污染序列、鑲嵌克隆及長度小于100 bp的序列。聚類和拼接的目的就是將來自同一個(gè)基因或同一個(gè)轉(zhuǎn)錄本的具有重疊部分(over-lapping)的EST整合至單一的簇(cluster)中，其目的是產(chǎn)生較長的一致性序列(con-sensus sequence)，用于注釋。基因注釋及功能分類就是用BLAST等序列連配工具，將一致性序列與核酸和蛋白質(zhì)的非冗余數(shù)據(jù)庫、蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域等進(jìn)行同源比對，獲得功能信息，完成基因注釋。基因注釋及功能分類的分析結(jié)果可用于比較基因組學(xué)分析、基因表達(dá)譜分析、新基因研究、可變剪切分析，此外，還要用Microarray、RT-PCR、Northern印跡雜交等實(shí)驗(yàn)手段進(jìn)行驗(yàn)證。

4．2 果樹的EST數(shù)據(jù)及分析

截至2007年12月14日，dbEST數(shù)據(jù)庫中歐亞種葡萄(Vitis vinifera)的EST數(shù)目已超過35萬，在所有生物中居第2l位；蘋果(Mdus×domestica)的EST數(shù)目達(dá)25.5萬，在所有生物中居第32位；柑橘屬植物(Citrus)的EST數(shù)目超過18萬。dbEST數(shù)據(jù)庫中EST數(shù)目比較多的一些果樹見表1。

分析主要是通過限制性酶切產(chǎn)生非常短的cDNA(9～14 bp)標(biāo)簽，然后通過連接和PCR擴(kuò)增，隨后對連接體進(jìn)行測序和分析。SAGE是以捕捉和分析mRNA 3’端的一段片段為基礎(chǔ)，主要基于3條原則：(1)一個(gè)9-14 bp的短核苷酸片段(SAGE標(biāo)簽)包含的序列信息足以代表其相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄物，例如，9 bp的核酸序列理論上能夠分辨262 144個(gè)(4⁹個(gè))不同的轉(zhuǎn)錄物，而一個(gè)典型的真核生物的轉(zhuǎn)錄物之和約為幾萬種。因此，一個(gè)SAGE標(biāo)簽?zāi)軌虼_認(rèn)唯一的一種轉(zhuǎn)錄物。(2)某一種標(biāo)簽出現(xiàn)的次數(shù)代表其所對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄物的拷貝數(shù)，根據(jù)其占總標(biāo)簽數(shù)的比例即可分析出其所對應(yīng)的編碼基因的表達(dá)頻率。(3)標(biāo)簽?zāi)軌螂S機(jī)連接在一起形成一個(gè)長的系列分子，能夠被克隆和測序。后來人們對SAGE技術(shù)進(jìn)行了一些改進(jìn)，通過增加標(biāo)簽的長度來提高注釋頻率(annotationfrequency)，這些改進(jìn)方法包括Modified SAGE(標(biāo)簽長度18 bp)、LongSAGE(標(biāo)簽長度21 bp)、Super—SAGE(標(biāo)簽長度26 bp)。

SAGE是以測序?yàn)榛A(chǔ)，采用數(shù)字化分析手段在轉(zhuǎn)錄水平上研究細(xì)胞或組織的基因表達(dá)模式的分子生物學(xué)技術(shù)，主要具有以下特點(diǎn)：(1)能夠快速地獲得整個(gè)基因組基因表達(dá)的全貌，提供基因定量表達(dá)的分布圖；(2)由于PCR擴(kuò)增片段短小(幾十個(gè)堿基對)，所以擴(kuò)增錯(cuò)誤被減少到最小。基因表達(dá)是統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。結(jié)果穩(wěn)定，可與數(shù)據(jù)庫中不同來源的數(shù)據(jù)相比較；(3)高度靈敏，可用于低豐度序列的確定；(4)操作相對簡便，具備PCR儀的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室都可以使用該技術(shù)；(5)只能分離特定時(shí)空下表達(dá)的基因，但不能分析基因的內(nèi)含子區(qū)域和基因間的調(diào)控序列。與基因芯片、mRNA差異顯示、差減雜交等分析基因表達(dá)的技術(shù)相比，SAGE具有尋找較低豐度的轉(zhuǎn)錄物，最大限度地收集基因組表達(dá)信息的優(yōu)點(diǎn)。但是SAGE結(jié)果分析時(shí)數(shù)據(jù)龐大，費(fèi)用較昂貴。測序結(jié)果的分析依賴于GenBank數(shù)據(jù)庫，特別是EST數(shù)據(jù)庫。

5．2 SAGE技術(shù)的應(yīng)用

SAGE技術(shù)可以同時(shí)反映正常或異常等不同功能狀態(tài)下整個(gè)基因組基因表達(dá)的全貌，提供基因定量表達(dá)的分布圖，而且結(jié)果穩(wěn)定、數(shù)據(jù)不變，因此，自SAGE技術(shù)問世以來，已被廣泛地應(yīng)用于高等生物的基因表達(dá)研究中。

Ibrahim等以大麥為試材，比較分析了SAGE與基因芯片在轉(zhuǎn)錄本豐度上的差別，利用SAGE技術(shù)從大麥2個(gè)獨(dú)立的文庫中共獲得82 122個(gè)標(biāo)簽，而Affvmetrix公司的大麥基因芯片上只包含有22791個(gè)探針。雖然SAGE獲得的基因表達(dá)結(jié)果與基因芯片獲得的基因表達(dá)結(jié)果是一致的，但是SAGE分析獲得的24.4％的單一標(biāo)簽在基因芯片上沒有相應(yīng)的探針。因此，SAGE技術(shù)目前是全面系統(tǒng)研究基因表達(dá)的首選策略。此外，SAGE技術(shù)能夠?qū)Σ煌h(huán)境、不同生理狀態(tài)、不同發(fā)育階段的組織細(xì)胞的基因表達(dá)情況進(jìn)行定性和定量分析，確定那些在特異組織中或特定發(fā)育階段特異表達(dá)的基因，鑒別出在外界脅迫(包括非生物脅迫和生物脅迫)下植物啟動(dòng)表達(dá)的基因。由于SAGE是一項(xiàng)較新的分子生物學(xué)技術(shù)，而且費(fèi)用較高，因此至今關(guān)于SAGE技術(shù)在果樹上應(yīng)用的研究報(bào)道寥寥無幾。Coemans等利用SAGE研究了香蕉葉片中基因表達(dá)，共獲得10196個(gè)標(biāo)簽，代表5 292個(gè)表達(dá)的基因。表明表達(dá)豐度高的轉(zhuǎn)錄本中大部分與能量產(chǎn)生(主要是光和作用)有關(guān)，發(fā)現(xiàn)最為豐富的轉(zhuǎn)錄本是類型Ⅲ金屬硫蛋白，其在總轉(zhuǎn)錄本中所占比例接近3％，這與在水稻上的研究結(jié)果類似。

6 問題和展望

基因芯片技術(shù)已經(jīng)有超過10 a的發(fā)展歷史，但是，至今在果樹上應(yīng)用的報(bào)道并不多，主要原因有二：一是基因芯片分析成本較高，二是目前商業(yè)化的基因芯片種類很少。目前商業(yè)化的果樹基因芯片主要是美國Affvmetrix公司開發(fā)的柑橘和葡萄的基因組芯片，柑橘基因組芯片(GeneChip Citrus GenomeArray)是基于柑橘屬的幾種植物和種間雜種的EST序列開發(fā)的，包括30 171個(gè)探針，代表33 879個(gè)柑橘轉(zhuǎn)錄本(http：//www.affvmetrix.condproducts/arrays/specific/citrus.affx)，而葡萄基因組芯片[Vitis vinifera(Grape)Genome Array]包括歐亞種葡萄(V.vinifera)的14 000個(gè)轉(zhuǎn)錄本和來自其它葡萄屬植物的1700個(gè)轉(zhuǎn)錄本，全面覆蓋歐亞種葡萄基因組(http：//www.affymetrix.com/products/arrays/specific/vitis.affx)。

就全基因組基因表達(dá)分析而言，SAGE技術(shù)是非常有前途的技術(shù)手段。隨著測序成本的下降和人們對序列信息分析能力的增強(qiáng)，SAGE技術(shù)將會在果樹上得到廣泛應(yīng)用。近2 a來，人們越來越重視對EST數(shù)據(jù)的分析，隨著人們對EST數(shù)據(jù)平臺和數(shù)據(jù)處理方法的理解和掌握，利用公共數(shù)據(jù)庫中的EST數(shù)據(jù)分析基因表達(dá)將成為蘋果、葡萄、柑橘、桃等果樹基因表達(dá)分析研究的重要手段。

利用組學(xué)(基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等)的原理和技術(shù)研究生物的機(jī)制正成為植物科學(xué)的發(fā)展趨勢。目前，基因芯片、SAGE和EST數(shù)據(jù)分析技術(shù)成為全基因組基因表達(dá)分析的主要方法。三者各有優(yōu)缺點(diǎn)，因此將不同分析方法的分析結(jié)果結(jié)合起來將會更準(zhǔn)確地反映基因及基因表達(dá)水平與高等生物生長發(fā)育、繁殖分化、衰老死亡等生命過程的關(guān)系。目前的基因表達(dá)分析方法是從轉(zhuǎn)錄水平上研究基因功能，要更全面地闡述基因功能，還需要對轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)控進(jìn)行研究。

表觀遺傳(Epigenetics)是指在不改變DNA序列的情況下由于基因表達(dá)的改變而導(dǎo)致性狀發(fā)生改變的現(xiàn)象。表觀遺傳變異發(fā)生的原因主要有DNA甲基化(DNA methylation)、RNA沉默(RNA silenc—inn)和組蛋白修飾(histone modification)等。近幾年來，表觀遺傳成為生物學(xué)的一個(gè)研究熱點(diǎn)，目前，已可以利用基因芯片技術(shù)對全基因組的DNA甲基化情況進(jìn)行分析。對于果樹而言，研究發(fā)育過程中的表觀遺傳變異問題具有重要的理論意義。隨著微繁殖苗的大量應(yīng)用，植物組織培養(yǎng)引起的表觀遺傳變異問題越來越引起人們的關(guān)注，目前我們正在就微繁殖導(dǎo)致草莓表觀遺傳變異的問題進(jìn)行較為全面系統(tǒng)的研究。