果樹中基因槍法遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展

摘要：目前，應(yīng)用于果樹遺傳轉(zhuǎn)化的方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和DNA直接導(dǎo)入法。介紹了DNA直接導(dǎo)入法中基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)的原理、類型和基因槍的轟擊參數(shù)、受體材料、基因型、轟擊前后的培養(yǎng)條件等對(duì)其遺傳轉(zhuǎn)化頻率的影響，并系統(tǒng)地概述了基因槍法在選擇標(biāo)記基因、報(bào)告基因、改良果樹性狀相關(guān)基因、啟動(dòng)子及多基因遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用研究進(jìn)展，同時(shí)對(duì)果樹基因槍轉(zhuǎn)化研究中存在的問題及應(yīng)用前景進(jìn)行了討論。

關(guān)鍵詞：果樹：基因槍；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)：S66 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-9980(2008)03-389-07

果樹為多年生植物，童期長(zhǎng)且遺傳背景比較復(fù)雜，屬于高度雜合體，其重要的農(nóng)藝性狀常受多基因控制。常規(guī)育種周期長(zhǎng)，選擇效率低，不能滿足生產(chǎn)發(fā)展的需要。現(xiàn)代基因轉(zhuǎn)化技術(shù)可以定向地改良果樹的遺傳性狀，縮短育種年限，擴(kuò)展遺傳改良范圍。目前，應(yīng)用于果樹遺傳轉(zhuǎn)化的方法主要有農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)法和DNA直接導(dǎo)入法。基因槍轉(zhuǎn)化法就是一種DNA直接導(dǎo)人法。由于其轉(zhuǎn)化的受體沒有物種限制，幾乎包括所有具潛在分生能力的細(xì)胞或組織，既解決了農(nóng)桿菌法受寄主限制，又避免了聚乙二醇(PEG)法、脂質(zhì)體(Lipo—some)法和電激法(Electroporation)等其它基因直接轉(zhuǎn)化技術(shù)中存在的原生質(zhì)體再生植株困難的問題，因此在果樹的遺傳轉(zhuǎn)化中雖不及農(nóng)桿菌介導(dǎo)法應(yīng)用的普遍，但也得到了一定的應(yīng)用。我們就基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)的原理、影響轉(zhuǎn)化頻率的主要因素及在果樹遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用研究進(jìn)展作綜述，以期為果樹的遺傳轉(zhuǎn)化研究提供參考。

1 基因槍轉(zhuǎn)化原理和類型

基因槍技術(shù)(Particle gun)又稱微粒轟擊技術(shù)(Particle bombardment technology)、生物彈道技術(shù)(Biolistic technology)，其原理是采用一種微粒加速裝置，使裹著外源基因的金粒或鎢粒獲得足夠高的動(dòng)量后，打人受體細(xì)胞或組織，并釋放出外源DNA，使DNA在植物細(xì)胞中整合表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。根據(jù)微粒加速系統(tǒng)的不同可以將基因槍分為火藥引爆型(Gunpower)、壓縮氣體型(Pneumatic)和高壓放電型(Electric discharge)等3種類型，目前，廣泛應(yīng)用的是以高壓氦氣為加速動(dòng)力的氣動(dòng)式基因槍。3種槍型在轉(zhuǎn)化原理、可控度、入射深度及轉(zhuǎn)化效率等方面都有差異。火藥式基因槍的粒子速度主要受火藥的數(shù)量及射程控制，不能無級(jí)調(diào)速，可控度較低，不能使微彈均勻有效地分布，轉(zhuǎn)化效率較低，且易使樣品受到污染。壓縮氣體型基因槍的動(dòng)力系統(tǒng)由氦氣、氮?dú)饣蚨趸嫉葋眚?qū)動(dòng)，可以通過調(diào)節(jié)氣體壓力有效地控制粒子的運(yùn)行速度。可控度高，金屬粒子分布較均勻，每槍之間的差異小。轉(zhuǎn)化效率較高。高壓放電型基因槍可通過改變工作電壓準(zhǔn)確地控制粒子速度和射入深度，使載有DNA的金屬粒子能夠達(dá)到較深的細(xì)胞層，因此可以有效地轉(zhuǎn)化各種類型的器官和組織，且轉(zhuǎn)化效率較高。

2 影響基因槍轉(zhuǎn)化頻率的因素

2．1 基因槍的轟擊參數(shù)

2．1．1 金屬微粒的種類 做微彈的金屬微粒目前一般多用金粉或鎢粉。鎢粉價(jià)廉。容易制備，但鎢粉與DNA結(jié)合時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)引起DNA降解，同時(shí)會(huì)形成對(duì)植物有害的氧化物。金粉易與DNA相結(jié)合，在植物細(xì)胞中的活性小于鎢粉，轉(zhuǎn)化率要高于鎢粉。Russell等在煙草懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入直徑為1.07 μm的鎢粉0～1 000 mg/L，培養(yǎng)1周后，發(fā)現(xiàn)100 mg/L鎢粉會(huì)使細(xì)胞的生長(zhǎng)量減少15％，同時(shí)發(fā)現(xiàn)至少1/2的細(xì)胞由于褐化而死：當(dāng)鎢粉的質(zhì)量濃度超過200 mg/L時(shí)，培養(yǎng)基中幾乎沒有存活細(xì)胞。而添加在培養(yǎng)基中直徑為1.0 txm的金粉不影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，且金粉比鎢粉的轉(zhuǎn)化頻率高達(dá)3倍。但金粉在水中趨向形成不可逆的結(jié)塊。須臨用前配制，且價(jià)格昂貴。

2．1．2 金屬微粒的大小 金屬微粒的大小對(duì)轉(zhuǎn)化也有一定程度的影響。微粒的直徑一般以0.6～4.0μm為宜，可根據(jù)不同的受體材料并參考其它的轟擊參數(shù)加以選擇。Hebert等在射程均為12.1 cm的情況下，用直徑分別為1.07μm(M10)和0.771μm(M5)的鎢粉轟擊葡萄雜種Chancellor(Vitis sp.)胚性懸浮細(xì)胞，結(jié)果顯示，M10在3個(gè)氦氣壓力下所產(chǎn)生的GUS(B-glucuronidase)基因瞬間表達(dá)率都顯著高于M5；且M10在隨氦氣壓力增強(qiáng)時(shí)，GUS基因的瞬間表達(dá)在不斷提高，M5卻在顯著下降。而Yao等發(fā)現(xiàn)M10在不同的氦氣壓力下，對(duì)橘柚(Citrus reticu—late BlancoxC.paradise Macf.)品種Page珠心的胚性懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率沒有明顯影響。Ye等用基因槍法轉(zhuǎn)化桃[Prunus persica(L.)Batsch]組織時(shí)，也得到與Hebert等不同的結(jié)果，當(dāng)使用鎢粒的直徑小時(shí)轉(zhuǎn)化率高，他們認(rèn)為這可能是樣品周圍的氣體能使鎢粒速度減慢，鎢粒越小，受到樣品周圍殘余氣體影響越大，減速越快。因此用小的鎢粒加上氦氣流可造成受傷細(xì)胞少，使轉(zhuǎn)化頻率增加。

2．1．3 DNA的純度和質(zhì)量濃度DNA的純度和質(zhì)量濃度均影響轉(zhuǎn)化頻率。DNA的純度越高，轉(zhuǎn)化效率就越好。但DNA質(zhì)量濃度并非越高越好，過高質(zhì)量濃度的DNA會(huì)使金屬微粒凝聚成塊，轟擊時(shí)使受體細(xì)胞遭受較大的機(jī)械損傷，而使轉(zhuǎn)化頻率降低：同時(shí)，金屬微粒對(duì)DNA的吸附能力還存在一個(gè)飽和值，研究得出，每毫克直徑為1.0、1.4、0.8 μm的鎢粉，吸附DNA的飽和效應(yīng)值分別為2.6、1.8、1.1 μg。Ye等發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA的質(zhì)量濃度對(duì)桃胚愈傷組織和胚軸的基因槍轉(zhuǎn)化有影響，當(dāng)DNA質(zhì)量濃度低時(shí)(0.8mg/L鎢粉)，2者的轉(zhuǎn)化率都低，當(dāng)質(zhì)量濃度增至1.6mg/L鎢粉時(shí)，轉(zhuǎn)化率增加，且GUS活性得到了最高表達(dá)，之后DNA質(zhì)量濃度再增加，其活性表達(dá)略有下降趨勢(shì)。張銀東等在用基因槍轉(zhuǎn)化香蕉(Musaspp.)試管苗幼芽時(shí)也發(fā)現(xiàn)。過高或過低的DNA質(zhì)量濃度均不能獲得較理想的轉(zhuǎn)化效率，他們認(rèn)為DNA質(zhì)量濃度以2～3 mg/L鎢粉較好。

2．1．4 DNA沉淀劑 為使DNA較好地附著在微彈上，制彈時(shí)需添加一定濃度的DNA沉淀劑，如CaCl2、亞精胺(spermidine)、聚乙二醇(PEG)等。如在香蕉的基因槍轉(zhuǎn)化中，王鴻鶴等發(fā)現(xiàn)DNA沉淀劑的組成以CaCl₂和亞精胺同時(shí)存在時(shí)可比其它處理得到更多GUS基因的瞬間表達(dá)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)CaCl₂的效果要優(yōu)于CaNO₃。不同型號(hào)的基因槍對(duì)沉淀劑的選擇也不相同，PDS-1000/He需要PEG的參與，AC-CELLTM則不需要。一般CaCl2的最適濃度在1.9～2.4 mol/L之間，亞精胺濃度介于7.69～76.9 mmol/L，聚乙二醇則選用25％PEG4000。亞精胺在微彈載體制備過程中容易引起金粉的凝結(jié)，且對(duì)植物細(xì)胞還有一定的毒害作用，因此在許多實(shí)驗(yàn)中都采取降低亞精胺濃度，適當(dāng)加入PEG。

2．1．5 轟擊時(shí)的物理參數(shù) 基因槍轟擊時(shí)的物理參數(shù)主要包括氦氣壓力、射程、彈膛內(nèi)的真空度、轟擊次數(shù)等。氦氣壓力和射程是影響轉(zhuǎn)化頻率的2個(gè)重要因素，各種植物材料對(duì)其要求不盡一致，轟擊時(shí)應(yīng)根據(jù)轉(zhuǎn)化受體材料的特點(diǎn)相應(yīng)的調(diào)整。Mesa等用直徑為1.6μm的金彈在不同氦氣壓力(4.5、6.2、7.6MPa)下用2種不同射程(3、9 cm)轟擊草莓(Fraeariaalzanossa Duch.)葉片外植體，發(fā)現(xiàn)15 d后，3 am的射程在3種氦氣壓力所得到的GUS表達(dá)均明顯的多于9 cm的射程；但25周后，卡那霉素的抗性植株獲得率以3 cm射程、6.2 MPa氦氣壓力的處理組合最優(yōu)。在用基因槍轟擊桑樹(Morus alba L.)胚軸、子葉、葉片及葉片愈傷組織等受體材料時(shí)。Bhatnagar等認(rèn)為氦氣壓力為1 100 Pa、射程為9 am時(shí)，2 d后所獲得的GUS表達(dá)最高。彈膛內(nèi)真空度是減少阻力，提高微彈速度的技術(shù)措施。雖然轉(zhuǎn)化頻率與彈膛內(nèi)的真空度呈正相關(guān)，但靶細(xì)胞對(duì)真空度具有一定的耐受性，所以彈膛內(nèi)的真空度應(yīng)有一定的限制。大多控制在0.05～0.095 MPa。轟擊次數(shù)也同樣影響轉(zhuǎn)化頻率，隨著轟擊次數(shù)的增加，雖然能提高瞬間表達(dá)頻率，但也會(huì)加大對(duì)細(xì)胞的傷害，因此，一般不應(yīng)超過3次，否則會(huì)降低轉(zhuǎn)化頻率。

2．2 受體材料和基因型

目前，在果樹上用于基因槍轉(zhuǎn)化的受體材料十分廣泛，幾乎包括所有具潛在分生能力的細(xì)胞或組織，如未成熟胚、子葉、體細(xì)胞胚、幼莖、愈傷組織、胚性懸浮細(xì)胞和莖尖分生組織等。其轉(zhuǎn)化頻率，即使是來自同一品種的不同受體材料，彼此間也會(huì)存在較大的差異。Ye等在用基因槍分別轉(zhuǎn)化桃胚愈傷組織、胚軸、子葉、未成熟胚、葉片和莖尖時(shí)發(fā)現(xiàn)：胚愈傷組織的GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)率最高，子葉次之，莖尖最低。Cabrera-Ponce等在用基因槍分別轉(zhuǎn)化番木瓜(Caricapapaya L.)品種Maradol的合子胚和體細(xì)胞胚時(shí)發(fā)現(xiàn)，體胚的轉(zhuǎn)化頻率高于合子胚，并且所有轉(zhuǎn)化的體胚都可以再生成植株。

用基因槍轉(zhuǎn)化不同果樹種類或品種相同類型的受體材料所得到的轉(zhuǎn)化率不同說明了基因型的影響。Bespalhok-Filho等試驗(yàn)了柑橘不同品種上胚軸切片GUS基因的瞬間表達(dá)情況，枳[Poncirus trifo-1iata(L.)Raf.]和甜橙[Citrus sinensis(L.)Osbeck.]的雜交種Carrizo每槍所產(chǎn)生的藍(lán)色斑點(diǎn)數(shù)為102個(gè)，而甜橙品種Pera僅為40個(gè)。Benelli等以來源于柿樹(Diospyros kaki L.F.)莖尖的愈傷組織為受體材料，經(jīng)金彈轟擊后發(fā)現(xiàn)，2個(gè)品種的每一外植體雖然都有GUS活性，但品種Jiro每外植體所具有的GUS斑點(diǎn)數(shù)是Kaki Tipo的1.6倍。

2．3 轟擊前后的培養(yǎng)條件

轟擊前對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，有利于提高轉(zhuǎn)化頻率。在轉(zhuǎn)化蔓越橘(Vaccinium macrocarpon Ait.)莖段時(shí)，轟擊前的預(yù)培養(yǎng)是轉(zhuǎn)化能否成功的關(guān)鍵因素，如果不經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)或預(yù)培養(yǎng)天數(shù)少于4 d，都見不到GUS基因的瞬間表達(dá)，以培養(yǎng)天數(shù)16 d為最好，超過18 d后，每一莖切段的藍(lán)點(diǎn)數(shù)會(huì)逐漸下降㈣。在含有2，4-D培養(yǎng)基上對(duì)番木瓜品種Maradol合子胚進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)2周比1周的轉(zhuǎn)化頻率高4.44倍。

轟擊后的材料，在一定時(shí)間內(nèi)只進(jìn)行抑菌培養(yǎng)而不進(jìn)行篩選，有助于修復(fù)因轟擊對(duì)材料造成的機(jī)械損傷，可提高轉(zhuǎn)化頻率。在以胚性愈傷組織為受體，轟擊后經(jīng)體胚誘導(dǎo)至魚雷期時(shí)，再用含有潮霉素(hygromycin)0.4 mg/L的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，是獲得葡萄(Vitis vinifera L.)轉(zhuǎn)化株的關(guān)鍵因素。否則，轟擊后的愈傷組織會(huì)壞死。被轟擊后的外植體形成愈傷組織和再生的培養(yǎng)基成分對(duì)提高轉(zhuǎn)化效率也很重要。以每升中加入3 g活性炭的培養(yǎng)基培養(yǎng)轟擊后葡萄胚性懸浮細(xì)胞，并以封口膜parafilm把培養(yǎng)皿封口使表達(dá)報(bào)告基因GUS的細(xì)胞增加3～4倍。

在轟擊前后對(duì)外植體作一定的滲透處理也有助于提高轉(zhuǎn)化頻率。Yao等在轟擊前用不同濃度山梨醇和甘露醇作滲透劑，發(fā)現(xiàn)滲透處理的應(yīng)用可明顯提高橘柚Page外源GUS基因的瞬時(shí)及長(zhǎng)期表達(dá)率，當(dāng)混合濃度達(dá)到0.6 mol/L(甘露醇0.3 mol/L+山梨醇0.3 mol/L)時(shí)，與不做滲透處理的相比，可提高轉(zhuǎn)化率5倍左右。王鴻鶴等在轟擊前4 h至轟擊后16 h用0.2 mol/L甘露醇高滲處理香蕉薄片外植體，可以獲得較高的GUS基因瞬間表達(dá)率，較未處理的外植體提高3.86倍左右。滲透處理可使細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離，而細(xì)胞的質(zhì)壁分離可能會(huì)減少轟擊后由于細(xì)胞質(zhì)溢出而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，從而使轉(zhuǎn)化頻率增加；同時(shí)，滲透又是一種協(xié)迫，對(duì)外植體會(huì)造成一定的傷害，因此，當(dāng)滲透劑的濃度過高時(shí)，反而會(huì)降低轉(zhuǎn)化頻率。

3 基因槍技術(shù)在果樹遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用

3．1 選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因的轉(zhuǎn)化

選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因常用于研究影響遺傳轉(zhuǎn)化的各種因子，諸如基因槍轟擊參數(shù)、外植體類型和離體培養(yǎng)條件等，來探索遺傳轉(zhuǎn)化的可能性，為導(dǎo)人有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的目的基因創(chuàng)造條件。

Hebert等用裹有GUS和NPTⅡ(neomycinphosphotransferaseⅡ)基因的鎢粒轟擊雜種葡萄Chancellor的胚性懸浮細(xì)胞，獲得了長(zhǎng)期表達(dá)GUS基因的愈傷組織，直到3 a后，Kikkert等才從這種愈傷組織中再生出植株，并經(jīng)Southern檢測(cè)證實(shí)NPTⅡ基因確實(shí)導(dǎo)人了再生植株體內(nèi)。Sagi等舊用香蕉品種Bluggoe(基因型為ABB)的胚性細(xì)胞懸浮系為受體，利用基因槍將GUS基因轟入受體細(xì)胞，獲得了抗性植株，經(jīng)PCR及Southern blot檢測(cè)，證明外源基因已整合入受體基因組中。Matsumoto等分別用質(zhì)粒(含有外源基因ahas和GUS)pGAl和oMD4(含有外源基因NPTⅡ和GUS)包被的鎢粒轟擊香蕉品種Maca的胚性懸浮細(xì)胞，經(jīng)GUS、PCR和Southern blot檢測(cè)，均獲得了轉(zhuǎn)基因植株，且2者之間沒有明顯差異，證明ahas基因賦予的除草劑(I-mazapyr)抗性，可用于抗性植株的篩選。賴鐘雄等以含選擇標(biāo)記基因HPT(hygromycine phosphotrans-ferase.HPT)和報(bào)告基因GUS的質(zhì)粒pCAMBIAl301作為供體質(zhì)粒DNA，采用基因槍轟擊的方法轉(zhuǎn)化經(jīng)荔枝(Litchi chinensis Sonn)品種下番枝幼胚誘導(dǎo)的長(zhǎng)期胚性愈傷組織，獲得18株穩(wěn)定表達(dá)GUS的轉(zhuǎn)基因植株。Sugimura等通過調(diào)查48 h后桑樹葉片細(xì)胞GUS基因瞬時(shí)表達(dá)率的高低，發(fā)現(xiàn)微彈的大小、轟擊次數(shù)、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間等因素對(duì)轉(zhuǎn)化頻率有顯著影響。

Scorza等以無核葡萄未成熟的合子胚誘導(dǎo)產(chǎn)生的體細(xì)胞胚為受體材料，體細(xì)胞胚先被基因槍轟擊2次，然后與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)(含NPTⅡ和GUS基因)，最后經(jīng)Southernblot檢測(cè)獲得了轉(zhuǎn)基因植株，并提高了轉(zhuǎn)化頻率。May等以香蕉品種Grand Nain帶有2～4個(gè)葉原基的莖頂端分生組織2～3 mm厚的橫切圓片和3～5 mm高的等分縱切薄片為受體材料，先用未包被外源基因的金彈轟擊受體組織，產(chǎn)生微傷后，再用加有乙酰丁香酮的(AS)的農(nóng)桿菌液侵染，同時(shí)以直接用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的作對(duì)照，最后都得到了抗性植株。經(jīng)檢測(cè)，所有的抗性植株都含有外源基因GUS和NPTⅡ。只是先用微彈轟擊后再用農(nóng)桿菌侵染的轉(zhuǎn)化效率有所提高。Mesa等用包被根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞的金粉粒轟擊草莓品種Chandler的葉片，獲得69％的抗性外植體和20.7％的抗性芽，比農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉片轉(zhuǎn)化分別高4.5和2.9倍，而單用基因槍轉(zhuǎn)化，只獲得26.6％的GUS瞬間表達(dá)，且15 d后所有外植體不再顯GUS活性；當(dāng)用空彈轟擊造成微傷后再用農(nóng)桿菌侵染草莓葉片，所獲得的抗性外植體及抗性芽與農(nóng)桿菌法相似，并沒有提高轉(zhuǎn)化率。Gutierrez-E等以酸橙(Citrus aurantium L.)品種Key lime試管苗幼嫩莖段為受體材料，先用基因槍在不同壓力下空彈轟擊2次，再用農(nóng)桿菌侵染，發(fā)現(xiàn)受體莖段再生的芽數(shù)顯著減少，并且沒有任何再生芽顯GUS陽(yáng)性。Bouamama等研究認(rèn)為，基因槍的空彈轟擊會(huì)對(duì)外植體造成創(chuàng)傷，而創(chuàng)傷有利于農(nóng)桿菌對(duì)外植體的侵染。這雖在葡萄和香蕉上獲得成功，但對(duì)酸橙和草莓不是很有效，而以金粉包裹菌體細(xì)胞作為微彈轟擊草莓，卻顯著提高了轉(zhuǎn)化頻率。

3．2 轉(zhuǎn)化目的基因改良果樹性狀

3．2．1 轉(zhuǎn)化抗病基因 長(zhǎng)期以來，果樹病害的防治主要靠傳統(tǒng)的抗病育種、農(nóng)藥防治、組織脫毒及合理栽培等措施，這些方法不僅耗時(shí)、耗力、污染環(huán)境，而且效果不理想。植物基因工程技術(shù)的應(yīng)用研究，為培育果樹抗病新品種開辟了一條新途徑，其中利用基因槍法轉(zhuǎn)移幾丁質(zhì)酶基因、病毒外殼蛋白基因、病毒復(fù)制酶基因等抗病(毒)基因，已有成功報(bào)道。

Kikkert等報(bào)道，用基困槍法轉(zhuǎn)化來自葡萄雜種Chancellor和品種梅爾諾花藥及霞多麗子房的胚性懸浮細(xì)胞。獲得抗真菌病害的含有幾丁質(zhì)酶基因(chitinase gene)的轉(zhuǎn)化植株。Remy等用帶有編碼抗真菌的嵌合體基因(Dm-AMPl)的微彈轟擊胚胎發(fā)生細(xì)胞懸浮系，獲得了抗真菌(如Mycosphaerellafiiiensis.Fusarium oxvsporum f.cubense)的轉(zhuǎn)基因香蕉品種Three Hand Planty，經(jīng)ELISA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)溫室轉(zhuǎn)基因植株葉片的抗真菌蛋白(DM-AMPl)的含量占總蛋白含量1.3％以上。Scorza等用1.0 μm的金彈轟擊無核白試管苗葉片誘導(dǎo)產(chǎn)生的體細(xì)胞胚，轟擊2次后再與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，最后經(jīng)Southern檢測(cè)證實(shí)溶菌酶shirva-1基因已經(jīng)導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)。

林德球等用金彈轟擊香蕉試管苗生長(zhǎng)點(diǎn)組織，經(jīng)PCR檢測(cè)和Western blot分析，獲得4株具有香蕉束頂病毒(Banana bunchy top virus，BBTV)復(fù)制酶基因整合表達(dá)的T₀代轉(zhuǎn)基因植株。Becker等以Grand Nain(基因型為AAA)香蕉未成熟的雄花為外植體，先誘導(dǎo)胚性愈傷組織，再誘導(dǎo)胚性懸浮細(xì)胞系，然后以此作為轉(zhuǎn)移外源基因的受體材料。用質(zhì)粒oBT6.3-Ubi-NPT與質(zhì)粒pUbi-BTintORF1或質(zhì)粒oUbi-BTutORF5等量混和(其中ORFl，ORF5為香蕉束頂病病毒外殼蛋白基因的部分序列)后，采用基因槍法共轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，獲得抗性植株，經(jīng)組織化學(xué)及分子生物學(xué)檢測(cè)，證實(shí)外源基因已穩(wěn)定整合入香蕉基因組中。Fitch等用基因槍法轉(zhuǎn)化番木瓜品種Sunset及Kapoho的未成熟胚、Kapoho的胚軸和來源于它們的體細(xì)胞胚，經(jīng)GUS染色、PCR、South-ern、Northern及病毒侵染檢測(cè)，獲得含有番木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白基因(Papaya ringspot virus-coat pro-tein，PRV-CP)轉(zhuǎn)化植株。

3．2．2 轉(zhuǎn)化抗除草劑基因 Sripaorava等報(bào)道，用裹有報(bào)告基因GUS及抗除草劑基因(Bar)的金粒轟擊培養(yǎng)28~42 d菠蘿品種Phuket試管苗大約1.5am長(zhǎng)的葉片(第4到第7節(jié)位)，經(jīng)RT-PCR及Southenblot檢測(cè)，抗除草劑基因已轉(zhuǎn)入植株中。溫室噴施除草劑Basta試驗(yàn)進(jìn)一步證明，Bar基因已獲得成功轉(zhuǎn)化。Druart等用裹有外源目的基因的金彈轟擊櫻桃砧木Damil(Prunus dawyckensis GM61/1)，In-mil(P.incisa×serrulaGM9)及甜櫻桃品種薩米脫(Summit)(P.avium L.)0.1 mm大小的試管苗莖頂分生組織，經(jīng)組織化學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)，Bar基因已轉(zhuǎn)入Damil基因組中，但經(jīng)Basta抗性試驗(yàn)證明轉(zhuǎn)化的試管芽苗是嵌合體。

3．2．3 轉(zhuǎn)化抗蟲基因 Serres等報(bào)道用高壓放電型基因槍轉(zhuǎn)化蔓越橘試管苗幼嫩莖段，經(jīng)GUS染色、PCR及Southen blot檢測(cè)，證明抗蟲基因(Bt)已轉(zhuǎn)入再生植株中。昆蟲飼喂實(shí)驗(yàn)表明，蟲子的死亡與其中的一個(gè)轉(zhuǎn)基因株系有關(guān)。

3．2．4 轉(zhuǎn)化抗旱耐鹽基因 王俊麗等通過基因槍法將來源于大麥(Hordeum vulgare L.)的胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白基因LEA₃導(dǎo)入由草莓品種Darslect花藥誘導(dǎo)的愈傷組織細(xì)胞中，經(jīng)除草劑PPT的4次篩選培養(yǎng)，獲得了抗性植株，Southern雜交分析進(jìn)一步表明，LEA₃基因已整合到草莓染色體基因組中。

3．2．5 轉(zhuǎn)化多酚氧化酶基因 多酚氧化酶(polyphe-nol oxidase.PPO)通常與果實(shí)褐變有關(guān)，尤其在長(zhǎng)期低溫冷藏條件下，會(huì)促進(jìn)菠蘿果肉褐變，導(dǎo)致黑心病的發(fā)生，影響果實(shí)品質(zhì)。利用基因工程技術(shù)可控制多酚氧化酶基因的表達(dá)水平，延緩并減輕果實(shí)褐變的危害。Graham等用基因槍法將從菠蘿果實(shí)中克隆的多酚氧化酶基因，通過反義核酸途徑轉(zhuǎn)化由組培苗葉片誘導(dǎo)的愈傷組織中，經(jīng)PCR及Southen blot檢測(cè)，獲得了轉(zhuǎn)基因芽苗，轉(zhuǎn)化頻率為1％。

3．3 多基因轉(zhuǎn)化

同時(shí)將多個(gè)目的基因?qū)胫参锘蚪M，一般所采取的策略是：將多個(gè)目的基因用表達(dá)結(jié)構(gòu)隔開，或直接融合在一起，構(gòu)建多基因表達(dá)載體(Cointegratevector)，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，即整合轉(zhuǎn)化；或是將多個(gè)目的基因分別構(gòu)建多個(gè)表達(dá)載體后，再進(jìn)行多次轉(zhuǎn)化或一次性轉(zhuǎn)化，即共轉(zhuǎn)化(co-transfomation)。由于基因槍法轉(zhuǎn)化容量大，一次能導(dǎo)人12-14個(gè)不同質(zhì)粒，總長(zhǎng)約600 kb的DNA，因此認(rèn)為這是實(shí)現(xiàn)多基因轉(zhuǎn)化較理想方法。

Remy等對(duì)香蕉胚性懸浮細(xì)胞進(jìn)行2種質(zhì)粒的基因槍轉(zhuǎn)化，其中一個(gè)質(zhì)粒分別含有選擇標(biāo)記基因A和抗真菌蛋白基因B2個(gè)外源基因。另一質(zhì)粒含有外源抗真菌蛋白基因C，經(jīng)PCR和Southern雜交檢測(cè)，證明70％～80％的轉(zhuǎn)化體同時(shí)帶有3種基因。Vidal等報(bào)道，他們將攜有外源NPTⅡ基因的質(zhì)粒(pSAN237)分別與其它含有不同數(shù)目外源抗菌肽基因(antimicrobial peptide gene)的4種質(zhì)粒組合，采用基因槍法轉(zhuǎn)化葡萄釀酒品種霞多麗花藥或子房的胚性懸浮細(xì)胞，經(jīng)PCR和DBH(dot blot hybridiza-tion)檢測(cè)，在148個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中平均共轉(zhuǎn)化頻率達(dá)到50％。樊軍鋒等利用葉盤法和基因槍相結(jié)合的方法進(jìn)行了美味獼猴桃(Actinidia deliciosa)品種秦美的遺傳轉(zhuǎn)化研究，他們先用包被質(zhì)粒pBIGM(含mtlD/gutD雙價(jià)基因)的鎢粉轟擊3 mm×3 mm大小的葉盤，然后將葉盤在LBA4404(其上攜帶有mtlD/gutD雙價(jià)基因)菌液中浸2～3 min。再經(jīng)誘導(dǎo)得到抗性轉(zhuǎn)化植株，PCR及耐鹽實(shí)驗(yàn)初步證明耐鹽基因轉(zhuǎn)化獲得成功。

3．4 對(duì)啟動(dòng)子特性的研究

具有組織特異性的啟動(dòng)子只有將其轉(zhuǎn)入特定的組織部位，才能對(duì)其特性進(jìn)行研究。由于基因槍轉(zhuǎn)化法的受體材料廣泛，而被認(rèn)為是研究啟動(dòng)子的較理想方法。

Sagi等構(gòu)建了5個(gè)質(zhì)粒表達(dá)載體：pBI364[35S-35S->gus->Nos-T]、pBl426[35S-35S(AMV)->gus-neo->Nos-T]、pBl505[35S-35S(AMV)->gus->Nos-T]、pEmuGN[Emu->gus->Nos-T]和pAHC27[U-bi->gus->Nos-T]，以香蕉品種Bluggoe的胚性懸浮細(xì)胞為受體，用基因槍法分別將上述5種質(zhì)粒轟入受體細(xì)胞，研究其瞬時(shí)表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，帶有Ubi啟動(dòng)子的GUS基因瞬時(shí)表達(dá)率最高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)帶有35S-35S啟動(dòng)子與AMV前導(dǎo)序列的GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)率明顯高于只帶35S-35S啟動(dòng)子的GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)率。Remy等也做了相關(guān)研究，他們用嵌有抗真菌基因(Dm-AMPl)的不同質(zhì)粒，以鎢粉做載體轟擊香蕉胚性懸浮細(xì)胞，研究不同啟動(dòng)子對(duì)Dm-AMPl表達(dá)活性的影響，也發(fā)現(xiàn)ubi啟動(dòng)子的活性最強(qiáng)，分別比增強(qiáng)型CaMV35S及超級(jí)啟動(dòng)子(Super promoter)葉片中Dm-AMPl蛋白含量高6-16倍和9-30倍。

4 問題與展望

綜上所述，近年來基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)在果樹上的應(yīng)用研究取得了較大進(jìn)展和成就，葡萄、香蕉、草莓、蔓越橘、菠蘿等幾種果樹均獲得了一些具有重要農(nóng)藝性狀的轉(zhuǎn)基因植株。但仍存在很多亟待解決的問題：(1)盡管已有10多種果樹采用基因槍轉(zhuǎn)化法獲得了轉(zhuǎn)基因組織或植株，但主要集中在香蕉、葡萄的遺傳轉(zhuǎn)化研究上，且還有很多果樹，如蘋果、梨、李、杏等還未見報(bào)道。(2)基因槍轉(zhuǎn)化法在實(shí)踐應(yīng)用中仍存在著轉(zhuǎn)化成本高、轉(zhuǎn)化頻率低、轉(zhuǎn)基因植株再生能力差、易形成嵌合體、外源質(zhì)粒不整合、轉(zhuǎn)入基因的拷貝數(shù)變化較大外源基因在轉(zhuǎn)化株各器官或組織中表達(dá)不一致、繼代后有丟失現(xiàn)象等問題：而且轉(zhuǎn)化目的基因成功的果樹，如番木瓜、香蕉、葡萄等部分轉(zhuǎn)化株，其轉(zhuǎn)化受體材料是有性的(未成熟胚、胚軸或胚愈傷組織)，就果樹而言，轉(zhuǎn)化有性材料遠(yuǎn)不如無性材料意義大。(3)目前，在果樹上基因槍轉(zhuǎn)化成功的外源基因大多是微生物來源的，具有實(shí)用價(jià)值的目的基因較少。要實(shí)現(xiàn)定向改良果樹的經(jīng)濟(jì)性狀，還必須不斷獲得與改良性狀密切相關(guān)的目的基因。(4)要獲得新的果樹品種或種質(zhì)，必須要考慮轉(zhuǎn)基因植株中外源基因的表達(dá)及調(diào)控問題。因?yàn)橥庠椿蚰芊駵?zhǔn)確、有效地在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)，直接影響其利用價(jià)值。目前。關(guān)于基因槍轉(zhuǎn)化的外源基因在果樹中的表達(dá)規(guī)律研究還鮮有報(bào)道。(5)向細(xì)胞核導(dǎo)入外源基因的核轉(zhuǎn)化技術(shù)是果樹基因工程的主要方法，但線粒體和葉綠體的遺傳系統(tǒng)同樣重要。現(xiàn)已證明，基因槍法可將外源基因?qū)爰?xì)胞器，并在酵母線粒體、衣藻的葉綠體及油菜葉綠體上獲得成功，目前尚未見到在果樹作物上的成功報(bào)道。

相信隨著果樹分子生物學(xué)的飛速發(fā)展、基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)的不斷完善和設(shè)備的不斷改進(jìn)，基因槍必將在果樹遺傳轉(zhuǎn)化研究中發(fā)揮更大的作用，展示光明前景。