葉綠體ＤＮＡ分析技術(shù)及其在栗屬植物中的應(yīng)用

摘要：被子植物葉綠體DNA母性遺傳，有獨(dú)立的進(jìn)化路線，基于葉綠體DNA的分析技術(shù)在分子系統(tǒng)學(xué)、資源多樣性評(píng)價(jià)、雜種鑒定等方面具有重要作用。栗屬植物資源豐富，分布廣泛。概述了葉綠體DNA分析技術(shù)在栗屬植物中的研究進(jìn)展，闡述了包括PCR—RFLP、DNA雜交、葉綠體SSR標(biāo)記技術(shù)和葉綠體基因區(qū)段測(cè)序分析技術(shù)在內(nèi)的分子標(biāo)記技術(shù)的原理、特點(diǎn)及其在栗屬植物中的應(yīng)用。并對(duì)今后如何開發(fā)葉綠體DNA標(biāo)記用于栗屬植物的研究進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：栗屬植物；分子標(biāo)記；葉綠體SSR標(biāo)記；PCR—RFLP標(biāo)記；葉綠體基因區(qū)段測(cè)序分析技術(shù)

中圖分類號(hào)：S664.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-9980(2008)03-396-04

殼斗科栗屬[Castartea(Tourn.)L.]植物廣泛分布于歐洲、亞洲及北美大陸的溫帶區(qū)域，是世界上重要的果樹作物之一。栗屬植物種類和類型繁多，John-son把栗屬劃分為7個(gè)種：板栗(C.mollissima B1.)、茅栗(C.seguinii Dode.)、錐栗[C.henryi(Skan)Re-hderWilson]、日本栗(C.crenata Sieb.Zucc.)、歐洲栗(C.sativa Mill.)、美洲栗[C.dentate(Marsh.)Brokh]、榛果栗(C.pumila Mill.)。分布在亞洲的有4個(gè)種，即日本和朝鮮半島的日本栗以及我國的特有種一板栗、茅栗和錐栗。我國是栗屬植物遺傳多樣性中心，而中國板栗是栗屬資源的原生種，分布地域廣，對(duì)栗疫病具有極強(qiáng)的抗性。歐洲栗僅分布于歐洲，東土耳其為其次生起源和遺傳多樣性中心。美洲栗和榛果栗分布于北美洲。近年來，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，利用葉綠體DNA分析技術(shù)研究栗屬資源取得了重要進(jìn)展。作者介紹了葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、幾種葉綠體DNA標(biāo)記技術(shù)的原理及其在栗屬植物中的應(yīng)用進(jìn)展，為進(jìn)一步保護(hù)和持續(xù)利用栗屬植物資源提供借鑒。

1 葉綠體基因組序列的特點(diǎn)

葉綠體DNA(chlproplast DNA.cpDNA)是1962年在藻類中發(fā)現(xiàn)的，大多數(shù)植物的cpDNA為閉環(huán)雙鏈DNA，原核生物型，大小為120～220 kb。含有2個(gè)長約22～25 kb的反向重復(fù)序列(Inverted repeat se-quence，IR)、大單拷貝區(qū)(Large single-COpy region，LSC)和小單拷貝區(qū)(Small single-copy region，SSC)。近年來許多植物分子系統(tǒng)學(xué)和遺傳分析研究都基于對(duì)coDNA的比較分析，是因?yàn)槿~綠體基因組序列有如下的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)：第一，cpDNA分子量小，多拷貝和結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，有利于對(duì)葉綠體基因組進(jìn)行分析。第二，與含有較多重復(fù)序列的核基因組和頻繁發(fā)生重排事件的線粒體基因組不同，葉綠體基因相當(dāng)保守。突變類型主要表現(xiàn)為點(diǎn)突變、堿基插入或缺失，進(jìn)化速率平均每年每個(gè)位點(diǎn)約為0.2～1.0×10⁹，僅為核基因的1/3。葉綠體非編碼區(qū)DNA進(jìn)化速率普遍高于編碼區(qū)序列，可分別適用于不同分類水平的系統(tǒng)演化。第三，cpDNA單性遺傳，有獨(dú)立的進(jìn)化路線，不依賴于其它任何數(shù)據(jù)即可構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，可為從歷史和系統(tǒng)發(fā)育的角度解釋生物多樣性提供可靠和準(zhǔn)確的信息。

2 cpDNA的PCR—RFLP分析技術(shù)

在細(xì)胞質(zhì)基因組分析中，基于PCR的RFLP分析方法比RFLP技術(shù)揭示的多態(tài)性更豐富，結(jié)論更可靠。因此，cpDNA的PCR-RFLP分析已成為目前葉綠體DNA系統(tǒng)學(xué)研究中使用最為廣泛的技術(shù)，也是遺傳多樣性研究、物種鑒別、雜種鑒定等研究領(lǐng)域的有力工具。PCR-RFLP主要用于堿基變異分析與比較，首先利用葉綠體保守引物擴(kuò)增特異區(qū)段，然后利用某種限制性內(nèi)切酶酶切處理。單堿基突變或序列重排的發(fā)生，可使某種限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)增加。減少或消失，導(dǎo)致限制性酶切片段長度發(fā)生改變，產(chǎn)生了限制性片段長度多態(tài)性。

PCR-RFLP分析中，最關(guān)鍵的是葉綠體引物的開發(fā)和選擇，現(xiàn)已有大批葉綠體PCR引物相繼報(bào)道。其中部分引物跨物種使用成功，從而發(fā)展成為通用引物(universal primer)，通用引物的使用對(duì)于研究遺傳背景不清的葉綠體DNA提供了極大的便利。

在山毛櫸科植物中，Magni等對(duì)Quercus rubra的cpDNA的多樣性進(jìn)行PCR-RFLP分析，并同其它山毛櫸科植物進(jìn)行比較，結(jié)果表明，3個(gè)擁有共同生活史的品種間存在很大差異。Vettori等對(duì)意大利山毛櫸(Fogus sylvatica)居群的cpDNA進(jìn)行PCR-RFLP分析，結(jié)果表明，在山毛櫸cpDNA中有一個(gè)顯著突變標(biāo)記，可用于對(duì)意大利的山毛櫸自然群體進(jìn)行細(xì)分，并且研究證明意大利南部的山毛櫸群體變異度最高。在栗屬植物中，F(xiàn)ineschi等㈣對(duì)38個(gè)歐洲栗居群進(jìn)行了葉綠體的PCR-RFLP分析，檢測(cè)到11種類型的葉綠體單倍型(haplotype)，而且證明cpDNA的遺傳多樣性與地區(qū)性關(guān)系并不密切，這些歐洲栗居群呈現(xiàn)出的種內(nèi)多態(tài)性可能是受到幾千年來人類活動(dòng)的影響產(chǎn)生的。

3 DNA雜交技術(shù)

葉綠體DNA雜交技術(shù)是指利用限制性內(nèi)切酶消化總DNA，凝膠電泳后分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，利用同位素或生物素標(biāo)記探針(異源的或同源的葉綠體基因片段)進(jìn)行雜交，最后比較雜交譜帶的差異?？梢岳眠@一技術(shù)研究植物類群間的親緣關(guān)系、遺傳多樣性、分類和系統(tǒng)進(jìn)化。它依據(jù)的原理是不同來源的基因片段部分同源，通過變性解鏈后互補(bǔ)的DNA重新復(fù)性，成為異源雙鏈的過程。在這一標(biāo)記技術(shù)中為了取得比較理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，往往使用同位素標(biāo)記探針，而且需要提取大量的總DNA，實(shí)驗(yàn)周期長；再者由于葉綠體基因高度保守，不易發(fā)生基因重排等原因，利用大的同源片段雜交在較低的分類學(xué)層次上很難檢測(cè)到變異類型，因此限制了這一技術(shù)在栗屬植物中的應(yīng)用。迄今還未發(fā)現(xiàn)利用異源的葉綠體探針研究栗屬資源的報(bào)道。

4 COSSR技術(shù)

葉綠體SSR(Chloroplast Simple Sequence Re-peat，cpSSR)標(biāo)記是近年來新發(fā)展起來的一種分子標(biāo)記，最先由Powell等提出，并在松樹中篩選出了第1批cpSSR引物。CpSSR的原理與核基因組SSR相同，都是以簡(jiǎn)單重復(fù)序列作模體，根據(jù)模體兩端的保守序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，因簡(jiǎn)單序列的重復(fù)數(shù)的不同而表現(xiàn)出多態(tài)性。葉綠體基因組中的微衛(wèi)星序列可以作為一種通用標(biāo)記來估計(jì)植物種群的遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳資源多樣性以及研究質(zhì)體的遺傳方式。由于cpSSR標(biāo)記技術(shù)同時(shí)具有SSR標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)又兼顧葉綠體基因組的特點(diǎn)，操作簡(jiǎn)便，多態(tài)性揭示能力強(qiáng)，安全可靠等而被廣泛應(yīng)用。

cpSSR標(biāo)記技術(shù)近幾年發(fā)展很快，已開發(fā)出多套適用于雙子葉植物和單子葉植物的cpSSR引物，并用于柑橘、水稻、獼猴桃、李、梨和歐洲冷杉、橡樹等木本植物和大田作物的相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)種內(nèi)水平存在較多變異，居群內(nèi)最大可以達(dá)到122個(gè)單倍型。但來自cpSSR序列間以及側(cè)翼序列的遺傳信息非常有限，僅在水稻中有所報(bào)道。葉綠體通用引物應(yīng)用范圍相對(duì)狹窄，僅局限在單子葉植物或雙子葉植物內(nèi)，在篩選合適的葉綠體通用引物時(shí)需要考慮引物的來源。

Sebastiani等報(bào)道了一批山毛櫸科葉綠體SSR引物，證明了山毛櫸科植物的3個(gè)主要種(Castaneasativa，F(xiàn)agus sylvatica和Ouerc.s petraea)的葉綠體DNA中存在單一和二核苷酸的微衛(wèi)星序列，并在種內(nèi)水平上發(fā)現(xiàn)了葉綠體微衛(wèi)星位點(diǎn)的變異，一些自然居群內(nèi)存在2或3個(gè)變異類型。甄貞等對(duì)栗屬植物cpSSR標(biāo)記體系進(jìn)行了優(yōu)化，從擬南芥、煙草等雙子葉植物中篩選出具有多態(tài)性的葉綠體SSR引物，用于研究栗屬植物資源遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)板栗資源種內(nèi)變異水平較高。

5 cpDNA基因區(qū)段測(cè)序分析技術(shù)

目前，一些葉綠體基因編碼區(qū)或基因間隔區(qū)的順序分析常用于不同分類水平的系統(tǒng)重建工作。葉綠體基因的編碼區(qū)和非編碼區(qū)序列進(jìn)化速率相差較大，適于不同分類階段的系統(tǒng)發(fā)育研究。編碼區(qū)的核苷酸與基因功能直接相關(guān)，自然選擇壓力較大，因而堿基替代速率相對(duì)較低，適用于科目等較高階元。cpDNA非編碼區(qū)(包括內(nèi)含子和基因間區(qū))在功能上的限制較少，與編碼區(qū)相比，非編碼區(qū)進(jìn)化速率更快，積累了更多點(diǎn)突變或插入/缺失突變，提供更多的信息位點(diǎn)。目前，rbcL、matK等cpDNA基因廣泛應(yīng)用于不同科目的系統(tǒng)發(fā)育研究中，而trnD-T，trnT-L.trnL-F等非編碼區(qū)常應(yīng)用于種屬間或種內(nèi)等較低分類階元的系統(tǒng)學(xué)研究。

葉綠體基因區(qū)段的測(cè)序分析技術(shù)在山毛櫸科植物中應(yīng)用廣泛，在栗屬植物中也有一定的研究。Kamiva等對(duì)Trigonobalanus verticillata coDNA的2個(gè)編碼區(qū)序列(rbcL和MarK)和3個(gè)非編碼區(qū)序列(atpB-rbcL spacer，trnL intron和trnL-trnF spacer)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，Trigonobalanus verticillata與栗屬植物的親緣關(guān)系最近，應(yīng)該是一種遠(yuǎn)古的栗屬植物。在栗屬植物中，F(xiàn)rascaria等吲對(duì)歐洲栗cpDNA編碼區(qū)的rbcL基因進(jìn)行研究，rbcL基因編碼1.5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶大亞基。位于植物cpDNA的大單拷貝區(qū)，長約1400 bp。結(jié)果表明，山毛櫸科家族rbcL基因的進(jìn)化速率比其它被子植物要低很多，這樣進(jìn)化較慢的cpDNA序列常被廣泛應(yīng)用于較遠(yuǎn)類群的系統(tǒng)學(xué)研究。編碼轉(zhuǎn)運(yùn)RNA的trnL基因位于cpDNA的大單拷貝區(qū)，長約390-615 bp的內(nèi)含子將trnL基因分隔為兩部分，與trnL基因間隔(長160-440 bp)不遠(yuǎn)處為trnF基因。這2個(gè)非編碼區(qū)序列能提供更多的信息位點(diǎn)，因此常被結(jié)合在一起測(cè)序分析。trnT和trnL基因相鄰，基因間區(qū)600～1 400 bp，這一間隔區(qū)在cpDNA中屬于分子進(jìn)化速率較快的非編碼區(qū)序列，常用于低分類水平上的研究。Lang等133J對(duì)栗屬植物葉綠體的trnT-L-F進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果表明非編碼序列區(qū)域富含AT。日本栗是栗屬植物最基本的分化枝，中國的3個(gè)種作為一個(gè)單元分枝，美洲栗與歐洲栗各為一個(gè)分枝，但兩者差異不大；基于葉綠體DNA的系統(tǒng)學(xué)分析也表現(xiàn)出與形態(tài)特征不一致的地方。

6 展望

在以上介紹的4種葉綠體DNA分析技術(shù)中，cpSSR技術(shù)由于操作簡(jiǎn)便、易于檢測(cè)分析、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，較其它3種葉綠體技術(shù)方法有著更為明顯的優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用前景廣闊。篩選有多態(tài)性的引物位點(diǎn)是葉綠體SSR技術(shù)最核心的環(huán)節(jié)，可通過2種主要的途徑獲取葉綠體SSR引物。首先，可以根據(jù)已知的葉綠體基因組序列利用軟件尋找微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)新的SSR引物，并進(jìn)行進(jìn)一步的篩選工作。其次，可以借鑒已公開發(fā)表的葉綠體微衛(wèi)星引物。

目前關(guān)于栗屬植物葉綠體基因組的研究取得了一些進(jìn)展，但鑒于使用材料有限，基因分析位點(diǎn)單一，對(duì)于反映栗屬植物系統(tǒng)演化和資源評(píng)價(jià)的真實(shí)情況所揭示出的信息位點(diǎn)還不夠充分，進(jìn)一步研究栗屬植物的演化和遺傳多樣性水平還需要提供更為廣泛、詳盡的胞質(zhì)DNA的證據(jù)。值得注意的是，只有將葉綠體DNA分子標(biāo)記所揭示的信息與核基因組信息和線粒體基因組信息結(jié)合起來，統(tǒng)一分析，才能更接近系統(tǒng)發(fā)育過程中真實(shí)的演化歷程。