梨矮化基因ｐｃＤｗ的ＳＳＲ標記定位

摘要：以矮化梨(Pyrus communis L.)與茌梨(P.bretschneideri Rehd.)的F₁雜交分離群體共110個單株(3 a生，矮化型和正常型各55株)為試材，對來自西洋梨的矮化型突變基因pcDw進行了SSR分子標記研究。用分離群體分組分析法(Bulked Segregant Analysis，BSA)，通過對源自梨、蘋果和桃基因組的共40對SSR(Simple Sequence Repeat)引物的篩選，獲得了一個與pcDw基因連鎖距離為9-3 cM的SSR標記KAl4210，由此將該基因定位到了梨品種Barlett遺傳圖譜的第16連鎖群上。

關鍵詞：梨；矮化性狀；pcDw基因；SSR標記；圖譜定位

中圖分類號：S661.2 文獻標識碼：A

文章編號：1009-9980(2008)03-404-04

梨是我國北方的主栽水果之一。目前，雖然矮化密植已發展成為果樹栽培的重要模式，然而，生產上適合梨高度矮密栽植的優良品種卻十分匱乏，主要原因是缺乏優良的矮化種質資源。1991年，我們從當時的英國東茂林試驗站(East Malling ResearchStation)引入西洋梨矮化型實生變異品種Le Nain Vert的種子，播種后獲得具有母本矮化性狀的實生后代，將其定名為矮化梨。該樹型最早來自1839年在法國發現的一個實生變異，它具有極為顯著的矮化特性。已有研究表明，該矮化性狀是一個受顯性單基因(pcDw)控制的質量性狀。所以，這是一個對梨樹型改良具有重要意義的基因資源。另外。由于該樹型還具有較高的觀賞價值，因此，該基因對觀賞樹木的樹型改造也有一定的意義。

SSR是一種高效、穩定的分子標記，呈共顯性，它非常方便于不同基因組圖譜間的比較與轉換。目前。SSR已發展成為一種十分重要的分子標記形式，已廣泛地用于揭示物種間的遺傳多樣性、遺傳作圖、性狀標記及定位等研究。在薔薇科的果樹上，已從蘋果、梨、桃、杏等，尤其是蘋果基因組中開發出了大量的SSR引物，并應用于基因組圖譜的構建。這些研究成果將極大促進對果樹重要農藝性狀的標記和定位研究。

我們試圖用BSA法，對來自梨、蘋果、桃基因組的部分SSR引物進行篩選，目的是在獲得與梨矮化基因pcDw連鎖的標記的同時，實現對該基因的圖譜定位，為進一步開展有關該基因的分子形成機制的研究奠定基礎。

1 材料和方法

1．1 材料

矮化梨(矮型親本)×茌梨(正常型親本)3 a生的F₁雜交群體，共有110個單株，其中，矮型、正常型各55株。所有試材均種植在青島農業大學萊陽果樹試驗站。

1．2 方法

1．2．1 DNA的提取 以春季萌動的幼芽為材料，參考田義軻等的方法分離純化基因組DNA。

1．2．2 對比基因池的構建 從F₁分離群體中分別抽取10株矮型個體和10株正常型個體，將其DNA等量混合，即為矮型基因池和正常型基因池。

1．2．3 SSR分析體系 在25 μL反應體系中含有DNA模板50 ng，正、反向引物各5 μmol/L，TaqE 1.2U.MgCl₂ 2.5 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L。PCR擴增遵循一般的程序，退火溫度與SSR引物序列來源文獻中一致。產物用5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，于凝膠成像系統中觀察拍照。SSR引物(序列及其來源見表1)由上海Sangon公司合成。TaqE購自大連TaKaRa公司。

1．2．4 標記的BSA篩選 用SSR引物先在親本和對比基因池間進行分析。對在矮型和正常型親本以及對應的對比基因池間表現相同多態性的片段，再用同一引物繼續在分離群體上進行驗證，以確定該片段是否與目標基因連鎖。

1．2．5 數據的統計與分析 統計標記片段在F₁群體中的分離情況，計算其與目標性狀的重組率，并用Kosambi函數估算遺傳距離。

2 結果與分析

先用目前已發表的來自梨基因組的SSR引物(共29對)進行BSA分析，結果表明，其中的KAl4可以擴增出與該矮化性狀連鎖的SSR標記，多態性片段為KA14₂₁₀(圖1)。在所分析的110個F₁單株中，共有10株表現標記與性狀重組的現象，即重組率為9.1％。Kosambi函數估算結果顯示，該標記與pcDw基因間的遺傳連鎖距離為9.3 cM。在Ya-mamato等2002年發表的梨基因組圖譜中，KAl4位于品種Bartlett的第10連鎖群(LGl0)上，因此，pcDw基因被定位于此連鎖群。在品種Bartlett的整個圖譜上，只分布了49個SSR標記，在品種Housui(豐水)的整個圖譜上，也僅有42個SSR標記。在2個品種的LG10上總共只有4個SSR標記，除了KAl4外，其余3個分別為NH007b、NH026a和M9a，前2者源自梨基因組，后者源自桃基因組。分析表明，它們與pcDw基因均無連鎖關系。2004年，Yamamato等借助于大量蘋果的SSR，將他們構建的梨基因組圖譜與蘋果的公共圖譜進行了對比分析，結果表明KAl4所在的連鎖群與蘋果的LGl6相對應。因此，本研究也對最新發表的蘋果第16連鎖群上均勻分布的部分SSR引物㈣進行了BSA分析，但沒有再獲得與pcDw基因連鎖的標記。

3 討論

已有多數報道，SSR在相近的物種間具有較好的通用性。例如，Yamamato等曾在梨的基因組圖譜上，定位了部分源自蘋果、桃和櫻桃的SSR。Lambert等在杏的基因組作圖中也用到大量來自桃等其它核果類果樹的SSR。蘋果是目前基因組作圖最為深入的仁果類果樹，在最新報道的圖譜上定位了156個SSR。而梨基因組的遺傳作圖研究還遠落后于蘋果，缺乏大量共顯性的SSR標記是其明顯的缺陷之一。由于梨與蘋果有較近的親緣關系。那么比較基因組作圖無疑是促進梨基因組圖譜構建進程的一個重要途徑。2004年，Yamamato等首次報道了梨與蘋果的比較基因組作圖結果，在梨品種Barlett和Housui的圖譜上分別定位了39和29個來自蘋果的SSR，這一研究結果將對梨樹性狀的標記和定位產生重要影響。

SSR標記在基因的圖譜定位上具有重要的利用價值。在蘋果Co基因的分子標記研究中，我們曾利用獲得的SSR標記實現了Co基因在蘋果公共圖譜LG10上的區域定位。本研究通過SSR標記KAl4210，將pcDw基因定位于Yamamato等2004年報道的梨品種Barlett的LGl6上。而在日本梨品種Housui的圖譜中，無該標記的出現，這也從DNA分子水平上印證了pcDw基因為來自西洋梨的突變的事實。

本試驗中，我們也試圖借助于梨、蘋果基因組的作圖研究成果，來開發更多與梨pcDw基因連鎖的SSR標記，雖然沒有獲得理想的結果，但就這個問題，還應繼續進行探討。另外，繼續利用各種分子標記手段，開發更多與pcDw基因連鎖的分子標記并展開其區域作圖研究，也將對該基因的精細定位具有重要意義。