隴東馬牙棗幼胚培養

摘要：以隴東馬牙棗盛花后50～60 d的幼胚為試材，采用L₉(3)⁴正交設計，篩選適宜的幼胚萌發培養基。結果表明，基本培養基、激素配比、蔗糖的含量對幼胚萌發都有顯著的影響；其中MS-H培養基的萌發率最高為47.62％；ZT最適宜含量為0.5 mg/L，IAA最適宜含量為0.6mg/L；較高的蔗糖含量(50 g/L)有利于胚的萌發。幼胚萌發的適宜培養基為MS-H+ZT0.5mg/L+IAA0，6mg/L+LH 0.5 g/L+蔗糖50g/L+瓊脂4.0g/L，剝去種皮，幼胚萌發效果較好。當胚萌發后，將胚從胚乳中或愈傷組織中剝離繼續誘導愈傷組織，再經誘導不定芽，生根獲得正常植株。

關鍵詞：棗：幼胚萌發；愈傷組織

中圖分類號：S665.1 文獻標識碼：A

文章編號：1009-9980(2008)03-418-04

胚培養技術是克服雜種胚早期敗育的有效方法，現已廣泛用于植物育種，在果樹育種中的應用研究尤為廣泛。棗胚培養雖有報道，但所涉及的品種很有限，且適宜于胚挽救的最小胚齡為花后50 d左右。而且，不同品種間的培養條件差異較大。一些敗育時期極早熟品種的胚挽救問題尚難解決，胚齡越小越難培養成功，且現有報道幼胚萌發率很低。幼胚萌發是建立棗幼胚培養體系的基礎和關鍵。我們以隴東馬牙棗坐果后50—60 d的幼胚為試材，進行幼胚萌發實驗最終獲得了再生植株，為通過生物技術改良、選育棗品種提供科學依據。

1 材料和方法

1．1 材料

隴東馬牙棗取自甘肅省農業科學院果樹研究所棗品種園，隴東馬牙棗2005年盛花期為6月18日，根據預備實驗的結果，采樣時間為2005年8月上旬棗盛花后50～60 d的幼胚。

1．2 方法

1．2．1 棗幼胚萌發培養基 根據前人研究和預備試驗的結果，幼胚萌發培養基采用L₉(3)⁴正交設計(表1)，每種培養基上接種30～40個外植體。培養基中均加入LH 0.5 g/L，pH 5.8-6.2，瓊脂4.0 g/L。

1．2．2 材料的消毒及接種 首先將棗果放人燒杯，加入洗衣粉清洗棗果表面贓物，然后用流水沖洗1～2 h，剝出種子，用流水沖洗1～2 h后置于超凈工作臺上用75％乙醇消毒2min，再用0.1％HgCl₂消毒8 min，最后用無菌水沖洗3～5次，采用2種接種方法：(1)直接接種于培養基上；(2)剝去種皮后接種于培養基上。10 d后觀察萌發率，去除污染株。1個月后統計出愈率(出愈率％=愈傷組織塊數/接種個數×100)和幼胚萌發率(萌發率％=萌發數/接種個數×100)，以胚有所生長或子葉展開定為萌發。

培養條件為：培養室溫度26～28℃，光照度2000～3 000 lx，光照時間12 h/d。

2 結果與分析

2．1 基本培養基對幼胚萌發的影響

結果表明，外植體按方法(1)接種30 d后一直無明顯變化，后來逐漸褐化，外植體按方法(1)接種30 d后剝去種皮轉接至棗幼胚萌動培養基上，無反應。最后干癟死亡。外植體按方法(2)接種10 d后胚可陸續變綠，有些培養基上20 d后胚乳開始腫脹，長出乳白色(有的略帶淡黃色)初生愈傷組織(圖版-A-F)。幼胚的萌發情況調查的結果如圖1。

從圖1可以看出。不同的基本培養基，愈傷組織誘導率、胚萌發率是不同的。盛花后50-60 d的幼胚Nitsch培養基誘導愈傷組織率最高，增殖速度較快，MS-H次之，MS最低。幼胚萌發率MS-H最高達47.62％，MS次之，Nitsch最低，3者差異在1％的水平達到極顯著。可見盛花后50-60 d的幼胚萌發的最適培養基為MS-H。3種基本培養基營養成分相比：大量元素Nitsch質量濃度最低，MS與MS-H大量元素、微量元素質量濃度相同，有機營養成分MS-H是11種，MS是5種，除VB₆質量濃度比MS的低外。其它有機營養成分的質量濃度相同或比MS的大；Nitsch的有機營養成分是7種，質量濃度與MS的有機營養成分相同或大。基本培養基的不同，實際上就是營養物質間的供應比率不同。胚的發育是一個動態過程，隨其成熟對營養條件的需求也不斷變化，胚齡越小對培養基的要求越嚴格。可見隴東馬牙棗幼胚培養需要高的無機鹽質量濃度，豐富的有機成分。

2．2 外源激素的不同配比對幼胚萌發的影響

從表2可以看出，當ZT質量濃度為1.5 mg/L時得到較高的出愈率(47.37％)；為0.5 mg/L時，出愈率最低，隨著ZT質量濃度的增大出愈率增大，且3者差異在1％的水平達到極顯著。當ZT質量濃度為0.5 mg/L時，胚萌發率最高52.38％，ZT質量濃度的增加，萌發率降低，差異在1％的水平達到極顯著。IAA為0.6 mg/L出愈率27.27％最低，萌發率54.55％最高。結果顯示ZT的最適宜的質量濃度為0.5 mg/L，IAA最適宜的質量濃度為0.6 mg/L，在含有MS-H+ZT 0.5 mg/L+IAA0.6 mg/L體現最好，可見ZT 0.5mg/L+IAA 0.6 mg/L為盛花后50-60 d幼胚萌發最佳激素配比。

2．3 蔗糖對幼胚萌發的影響

蔗糖在幼胚培養中具有3個方面的作用，即調節滲透壓、作為碳源和能源。在幼胚培養中，適宜的蔗糖對于幼胚萌發和萌發后生長比生長素和細胞分裂素的作用更為重要。從表3可以看出，30g/、50 g/L、80 g/L的蔗糖的出愈率分別為16.00％、37.5％、41.67％，胚萌發率為41.67％、50％、33.33％，差異在1％的水平達到極顯著。可見較高的蔗糖有利于胚的萌發，這與杜學梅等的結論相一致。MS-H+ZT 0.5mg/L+IAA 0.6 mg/L+LH 0.5 g/L+蔗糖50 g/L+瓊脂4.0 g/L是盛花后50～60 d幼胚萌發最佳培養基組合。

2．4 胚培養中愈傷組織不定芽和根的分化

將愈傷組織轉接在MS+BA1.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L+LH 0.5 mg/L+Vc 0.1 mg，L+蔗糖30 g/L再生出叢生芽(圖版-G)。將叢生芽苗，剪成2-3 cm的莖段接種在1/2MS+IBA 1.0 mg/L+Vc 0.1 mg/L+蔗糖20 g/L生-根培養基上，可有效誘導試管苗生根(圖版-H)。

3 討論

本試驗證實未去除種皮的隴東馬牙棗的種子接人培養基中，種皮很快褐化，使得幼胚在沒有萌發之前，胚珠已變黑死亡。在胚珠未變黑死亡之前，去除種皮的幼胚在接人培養基中，幼胚也不能繼續分化。這與祁業鳳等、郝慧的報道不一致。種皮的存在嚴重影響胚的萌發。應用去除種皮處理方式的胚培養研究很多。比如在早熟油桃幼胚陰、甜櫻桃幼胚及櫻桃種間雜交胚等都采用直接去除種皮或培養一段時間去除種皮，使胚培養獲得成功。由此可知，對種皮的簡單處理，不僅增加了水分及其它營養物質的滲入與胚代謝產物的排出，而且減輕了褐化現象，可有效提高胚萌發效率。

本試驗將種子剝去種皮后接種在幼胚萌發培養基上。先使幼胚胚性生長至子葉胚，將子葉胚從胚乳中或愈傷組織中取出后誘導愈傷組織，再由愈傷組織經過再分化發育成完整植株。本試驗獲得較高的幼胚萌發率。初步證明在幼胚離體培養的前期提供適宜的營養條件和外部條件，使其繼續胚性生長至子葉胚，提高胚培養的成活率是可行的。

胚培養能否成功，其關鍵之一就在于是否提供給胚合適的營養需要。一個正常植物胚胎發生過程是一個從合子進行第1次分裂開始由未分化狀態至分生組織形成、幼胚建立的連續、漸進的變化過程。在這個過程中，胚由只吸收營養時期過渡到制造營養時期。胚齡越小需要的培養基成分越復雜。本試驗結果表明隴東馬牙棗50-60 d的幼胚萌發的培養基需要高的無機鹽質量濃度，豐富的有機成分。