用正交試驗法優化金銀花多糖提取工藝

［摘 要］采用傳統的多糖提取方法。根據單因素實驗，確定了正交試驗的因素和水平，并通過正交試驗，比較了影響多糖含量的主要因素的主次關系，優化了提取條件，確定了最佳的提取工藝。并用苯酚——硫酸法測定了金銀花粗多糖樣品中糖的含量，通過氣相色譜法測定了待測樣品中的單糖組成。本文以金銀花粗多糖為研究對象，目的在于探索其未被發現的多糖及其所具有的生物活性，為進一步開發利用提供基礎資料。

［關鍵詞］金銀花 多糖 最佳條件 提取

［中圖分類號］Q94 ［文獻標識碼］A ［文章編號］1009－5489(2008)11－0245－03

一、實驗材料與儀器

1.材料

濃硫酸、6%苯酚、分析純葡萄糖、洗脫液、葡聚糖標準樣、金銀花等。

1.儀器

752型紫外分光光度計、恒流泵、水浴鍋、電熱恒溫鼓風干燥箱、分析天平、紫外檢測儀等。

二、實驗部分

1.金銀花水溶性粗多糖水提醇沉工藝

金銀花樣品用自來水沖洗，烘干制恒重，以水作為溶劑，采用不同的提取溫度、料液比、提取時間、提取次數進行實驗。水提液用紗布過濾。將濾液濃縮純沉過夜。沉淀離心，離心后脫水，沉淀用P2O5真空干燥過夜，即得粗多糖EP。

2.金銀花水溶性粗多糖提取工藝條件的選擇

(1)浸提時間對多糖含量的影響

在確定料液比為1：10，提取溫度為80℃的條件下，樣品浸提一次，分別以30min、45min、60min、90min、120min進行實驗。

(2)浸提溫度對多糖含量的影響

分別在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃五個溫度，下料液比為1：10，提取時間為90min，在不同溫度下，樣品浸提一次，根據多糖浸出量來選擇最佳浸提溫度。

(3)料液比對多糖含量的影響

在上述實驗確定的提取時間為90min、提取溫度為80℃條件下，分別以1：

10、1：20、1：30、1：40、1：50的料液比進行實驗。

(4)浸提次數對多糖含量的影響

在上述實驗確定的提取時間為90min、提取溫度為80℃、料液比1：30，對樣品選擇不同的浸提次數，根據多糖浸出量確定最佳浸提次數。

3.多糖含量的測定方法：采用苯酚——硫酸法

(1)以葡萄糖為標準樣制定標準曲線

精密稱取105℃干燥恒重的無水葡萄糖100mg于1000ml容量瓶中加蒸餾水定容。分別精取0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml標準溶液于大試管中，補加蒸餾水至1.0ml，以1.0ml蒸餾水為空白，分別加6%苯酚0.5ml，濃H2SO42.5ml，立即搖勻，室溫放置20分鐘以后于490nm測定密度，以橫坐標為多糖微克數，縱坐標為光密度值，繪出葡萄糖毫克數與OD值之間的標準曲線，并計算標準曲線的回歸方程。

(2)樣品多糖含量的測定

稱取最佳條件下提取的金銀花粗多糖樣品50mg，定容至500ml，然后取干燥潔凈試管，將樣品溶液、6%苯酚溶液、濃硫酸一次按1.0ml∶0.5ml∶2.5ml的比例加入，混勻，每個樣品平行做三管，在冷卻20分鐘后，靜止，蒸餾水坐對照，然后在490nm下比色，所得數值取平均值，對照標準曲線可得單寡糖與多糖含量。

三、結果與討論

1.提取工藝條件的討論

(1)浸提時間對多糖含量的影響

討論：由圖1可見，多糖含量隨時間的延長而增加，但90min之后增加不大。所以確定最佳的提取時間為90min。

(2)浸提溫度對多糖含量的影響

討論：由圖2可以看出，多糖含量隨溫度的升高而增加，70℃—90℃為較理想的提取溫度。在80℃后所得多糖含量基本不變，所以選定80℃為最佳提取溫度。

(3)料液比對多糖含量的影響

討論：由圖3可見，隨著料液比的增加多糖含量呈上升的趨勢，但料液比在1：30后，多糖含量基本不變，因此選擇1：30為最佳料液比。

(4)浸提次數對多糖含量的影響

討論：由圖4可見，隨浸提次數的增加，多糖的含量逐漸增大，在浸提3次后，多糖含量基本不變，因此選擇3次為最佳浸提次數。

(5)正交試驗

為了優化提取工藝條件，根據以上單因素實驗，本實驗選取了對提取率影響較大的四個因素及其三個水平：浸提時間(45—90min)、浸提溫度(60—90℃)、料液比(1：10—1：30)、浸提次數(1—3次)進行L9(34)正交試驗。確定正交試驗的因素和水平如表5所示。正交試驗結果見表6。

討論：實驗結果表明，金銀花粗多糖水提的最佳條件是按浸液比1：10在90℃煮提2次，每次60min。

2.苯酚——硫酸法測多糖含量的標準曲線

3.氣相色譜法分析多糖的組成

氣相色譜法的流動相是氣體(氫氣、氮氣等)，其固定相為特定液體被涂漬在一些擔體表面上；樣品均須氣化，樣品的定性和定量必須與標準品對照。

下圖為標樣及金銀花待測樣的氣相色譜圖

討論：對比得到金銀花待測樣含有鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖及葡萄糖等單糖。

四、結論

1.影響金銀花粗多糖提取的主要條件為溫度、時間、料液比和浸提次數。

2.在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗法得到金銀花粗多糖水提取的最佳工藝條件為：溫度為90℃、浸液比為1：10、浸提2次、每次60min。

3.用苯酚——硫酸法測定了金銀花粗多糖樣品中糖的含量24%。

4.通過氣相色譜法測定了樣品中的單糖組成。得到金銀花待測樣含有鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖及葡萄糖等單糖。

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