腦科ＩＣＵ院內感染鮑曼不動桿菌的分子分型和耐藥機制研究
2008-12-31 00:00:00張瓊麗張榮
中國社區醫師·醫學專業 2008年22期
摘 要 目的：分析腦科監護室院內感染的鮑曼不動桿菌的同源性，并研究其主要耐藥機制。主要是A型克隆株，對頭孢菌素和碳青烯類抗生素的耐藥性主要是由于產OXA-23型碳青霉烯酶。
關鍵詞 院內感染 鮑曼不動桿菌 同源性 耐藥機制
資料和法
病例和菌株來源：28株鮑曼不動桿菌系2004年4月～2005年10月由我院腦科監護室分離得到，均來自痰液標本。
培養基：哥倫比亞血瓊脂基礎、MH瓊脂、胰人豆蛋白胨肉湯均購自英國OXOID公司。抗生素：哌拉西林(PRL)、頭孢他定(CAZ)、頭孢噻肟(CTX)、哌拉西林／他唑巴坦(TZP)、頭孢哌酮／舒巴坦(SCF)、亞胺培南(IPM)、美羅培南(MEM)、環丙沙星(CIP)、阿米卡星(AK)均購自中國抗生素研究所。
試劑：PCR反應試劑購自上海申友生物技術有限責任公司，蛋白酶K、PMSF、Apal限制性內切酶、PFGE瓊脂糖、低熔點瓊脂均購自上海生工生物技術有限公司。
儀器：DNA擴增儀為美國PE公司產晶；脈沖場凝膠電泳儀，美國Bio-Rad公司；VITEK1微生物自動鑒定及藥敏系統為法國Biomerieux公司產品。
隨機鑒定卡：VITEK 1系統細菌鑒定卡為GNI+卡。
方法：細菌的鑒定和藥敏：細菌的鑒定采用全自動微生物鑒定和藥敏系統VITEK1鑒定，操作參照說明書進行。瓊脂釋法藥敏試驗：參照CLSI規定檢測抗生素對細菌的最小抑菌濃度(MIC)。脈沖場凝膠電泳(PFGE)：采用脈沖場凝膠電泳檢測細菌的同源性。將細菌單個菌落接種于LB肉湯中，37℃200轉／分，18～24小時，70001轉/分離心2分鐘，棄上清，用5×TE緩沖液 lml洗滌沉淀2次，離心棄上清，加TE緩沖掖，調整濁度到4個麥氏單位，取300μl與等量的2％低熔膠溶液迅速混勻，加入模塊中，4℃20分鐘。將膠吹入含800／ttg／ml的蛋白酶K中，50℃過夜，加TE緩沖液沖洗30分鐘，再加PMSF酶終止液(174μg／ml)放置lh，用TE緩沖液洗滌2~3次，取半塊膠用1×TE緩沖液120μl沖洗。4℃20分鐘。用ApaI(50U)37℃酶切24小時，上電泳，電泳條件為：1％膠120度角，6V／cm，轉換時間：0.22秒、18秒，電泳時間16小時。EB染色20分鐘。
結果判定：①酶切后圖譜完全一致為同型。②酶切后圖譜相比較有1~3條帶不同，為亞型；③酶切后圖譜相比較有3條以上條帶不同者，定為另一基因型。
聚合酶鏈式反應檢測耐藥基因：根據參考文獻報道的引物序列合成，引物序列用煮沸法進行模板DNA的提取，PCR反應體系為50μ，含1×PCR反應緩沖液，3．5mmol／L鎂離子，2mmol／LdNTPs，50μmol／L引物，1．6Utaq酶，5μl模板。PCR反應條件根據不同的引物而決定，并將PCR產物直接測序，將測序結果在GenBank上對比。
結 果
藥物敏感性：結果顯示28株菌除一株對所有抗生素均表現為敏感外，其余27株菌均顯示廣泛耐藥。
28株鮑曼不動桿菌對9種臨床常用抗生素廣泛耐藥，不僅對廣譜頭孢菌素、喹諾酮類抗生素和氨基糖苷類抗生素具有較高的耐藥性，而且對含酶抑制劑的復合抗生素也有較高的耐藥性，耐藥率達96.4 %。并且對碳青霉烯類抗生素也有較高的耐藥率，其亞胺培南和美羅培南的耐藥率均為96．4%。
細菌同源性檢測：脈沖場電泳檢測28株鮑曼不動桿菌的同源性，腦科監護室分離到的主要是A型(20株)。耐藥基因的檢測：用OXA-23，IMP-1，VIM的引物擴增并測序。
28株不動桿菌中沒有檢測到金屬酶基因，而多數不動桿菌(85．7％)攜帶OXA．23型碳青霉烯酶基因。
討 論
細菌耐藥性監測對準確掌握耐藥動向及指導臨床合理用藥具重要的意義。鮑曼不動桿菌目前已被認為是醫院感染中重要的一種革蘭陰性非發酵病原菌，其耐藥性在逐年上升。近年來，隨著廣譜抗菌藥物的廣泛應用，鮑曼不動桿菌引起的感染急劇增多，多重耐藥菌株迅速出現和日趨嚴重，且近年來出現了泛耐株，這些泛耐株幾乎對所有臨床常用抗菌藥物都耐藥。
不動桿菌的耐藥機制較為復雜，其對碳青烯類抗生素的耐藥機制主要有：①產生水解碳青烯類抗生素的D類碳青霉烯酶和B類金屬酶；②青霉素結合蛋白(PBPs)的改變；③外膜蛋白的改變和藥物主動外排有關［3］。我們對28株不動桿菌檢測了D類碳青霉烯酶OXA-23、B類金屬酶IMP-1和VIM-2等耐藥基因，結果顯示24株(85．7%)不動桿菌攜帶OXA-23耐藥基岡，這與我國不動桿菌流行碳青霉烯酶基因型相符［1，2］。
28株不動桿菌的同源性分析顯示，腦科監護室分離的28株鮑曼不動桿菌主要為A型克隆株，其他兩個克隆株分別為B和C型克隆株。說明我院腦科監護室A型克隆株流行。同時A型流行克隆株均存在有OXA-23基因，提示此菌株具有較高的耐藥性，提示我們應高度重視防治A型克隆株的流行。
不動桿菌在我院的耐藥現象較為嚴重，已成為醫院內病死率較高的感染菌之一。加強對不動桿菌的耐藥檢測，尤其是分子流行病學調查分析，不僅有助于指導臨床用藥，而且從分子水平上明確耐藥菌傳播來源，對我們有針對性地采取院內感染控制措施具有重大意義。
參考文獻
1 王輝，孫宏莉，寧永忠，等．不動桿菌屬多重耐藥及泛耐藥的分子機制研究．中華醫學雜志，2006，86：17-22.
2 楊青，徐小微，俞云松，等.碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌流行病學及碳青霉烯酶類型的研究，中華檢驗醫學雜志，2003，26：342-345．
3 Poirel L．and Nordmann R．Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii：mechanismsand epidemiology，Clinical Microbiology and Infection，2006，12：826-836．
