基質金屬蛋白酶－７在鼻咽癌中的表達及與腫瘤侵襲轉移的關系

摘 要 目的：觀察基質金屬蛋白酶-7(MMP-7)蛋白在鼻咽癌中的表達及與腫瘤侵襲轉移的關系。方法：采用成組設計的對照試驗方法，運用免疫組化及逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術，檢測MMP-7蛋白及mRNA在鼻咽癌及慢性鼻咽炎組織中的表達。使用方差分析、q檢驗、t檢驗和X²檢驗進行組間差異的統計學分析。結果：MMP-7蛋白在鼻咽癌中的陽性表達率為79.17%，明顯高于在慢性鼻咽炎中的表達率11.11%(P＜0.001)；MMP-7 mRNA在鼻咽癌中的陽性表達率為89.58%，表達量為0.467±0.199，顯著高于在慢性鼻咽炎組織中的表達率16.67%(P＜0.001)；MMP-7蛋白及mRNA的表達與鼻咽癌患者的性別、年齡無關，與鼻咽癌的T分期、N分期及臨床分期密切相關(P＜0.05)。結論：MMP-7在鼻咽癌中陽性表達率高，其表達隨著腫瘤浸潤深度、區域淋巴結轉移范圍和臨床分期的增加而增強，與鼻咽癌侵襲及轉移密切相關。

關鍵詞 鼻咽癌 腫瘤侵襲與轉移 基質蛋白酶-7

鼻咽癌(NPC)是我國常見的頭頸部惡性腫瘤，尤以中南各省高發，俗稱為“廣東瘤”。由于鼻咽癌是一種低分化、高轉移性惡性腫瘤，其治療失敗的主要原因仍然為局部區域性復發與遠處轉移，因而侵襲和轉移仍是導致鼻咽癌患者死亡的主要原因［1］。基質金屬蛋白酶-7(MMP-7)作為MMP家族中較為重要的基質降解素，已經發現其表達與消化道等惡性腫瘤的浸潤與轉移相關。我們檢測了MMP-7蛋白在鼻咽癌中表達水平，并探討其表達與腫瘤侵襲轉移的關系，旨在發現有預示作用的生物分子指標。現將實驗結果報告如下。

資料與方法

隨機選取2005年5月～2005年9月廣東醫學院附屬醫院耳鼻咽喉-頭頸外科就診的鼻咽癌病例48例。采用衛生部組織編寫的《鼻咽癌診治標準》第5版為病理組織學分型標準［2］，全國鼻咽癌分期專題研討會(福州，1992年)推薦的臨床分期方法為臨床分期標準［3］。納入標準：①根據臨床表現初步判定為鼻咽癌；②鼻咽原發癌組織活檢病理確診為鼻咽癌；③均行鼻咽部CT掃描明確腫瘤病灶范圍；④所有病例均為初診患者，未行放療或化療治療。48例鼻咽癌病例中，男34例，女14例，年齡47.63±13.58；臨床分期情況：Ⅰ期4例，Ⅱ期19例，Ⅲ期15例，Ⅳ期10例，其中T1 9例，T2 15例，T3 14例，T4 10例，N0 14例，N1 21例，N2 12例，N3 1例。經病理組織學檢查，48例鼻咽癌均為低分化鱗狀細胞癌。選取同期就診行鼻咽部活檢，并最終病理診斷為慢性黏膜炎癥的慢性鼻咽炎病例18例，作為對照組。

試劑與方法：①試劑采用SP-9000通用試劑盒、鼠抗人MMP-7單克隆抗體。RNA抽提試劑Trizol，一步法RT-PCR試劑盒，PCR引物(序列見表1)。②標本制備：于鼻內鏡直視下鉗取鼻咽部病變組織，將所取標本一部分置于中性福爾馬林液中固定，經脫水、透明、浸蠟后石蠟包埋保存，備用于免疫組化實驗。另取一部分標本保存于-70℃低溫冰箱中(所取標本質量≥300mg，并于取材后10分鐘內置于低溫冰箱內)，以備用于RT-PCR實驗。實驗物品去核糖核酸酶(RNase)處理。③免疫組化染色檢測方法：手術切除標本用10%甲醛固定，經脫水、透明、浸蠟后石蠟包埋保存。實驗前制成厚4μm連續石蠟切片，采用免疫組化SP法進行切片染色，染色步驟按照試劑盒及一抗說明書要求進行。用PBS液代替一抗作為陰性對照。結果由兩位觀察者采取盲法進行讀片。把制好的切片放于顯微鏡下觀察，正常組織取黏膜上3個高倍區域(×200)，癌組織選取癌細胞豐富的3個高倍區域(×200)。MMP-7在正常組織中一般不表達，在腫瘤細胞組織中可見細胞漿內棕黃染色，根據計算法［4］評定MMP-7陽性結果。④RT-PCR檢測方法：a.抽提RNA：采用Trizol一步法抽提RNA，經紫外分光光度計驗證后調整RNA濃度為1g/L后作RT-PCR反應。b.一步法RT-PCR反應：RT-PCR反應體系包括10×One Step RNA PCR Buffer 5μl、MgCl2 (25mM) 10μl、dNTP Mixture (10 mM) 5μl、RNase Inhibitor (40 U/μl) 1μl、AMV RTase XL (5 U/μl) 1μl、AMV-Ptimized Taq (5 U/μl) 1μl、上下游特異性引物 (20 μM)各1μl、實驗樣品(1μg Total RNA) 1μl、RNase Free dH2O 24μl。反應條件為50℃ 30分鐘、94℃ 2 分鐘、94℃ 30秒、52℃(為MMP-7的退火溫度，GAPDH的退火溫度分別為55℃)30秒、72℃1分鐘(PCR 反應共35Cycle)，最后72℃延10分鐘。c.PCR產物的半定量分析：擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠(EB)染色后在紫外燈下觀察、凝膠成像系統拍照成像。凝膠在UVP凝膠成像分析系統中掃描，用BandScan4.5圖形分析處理系統分析電泳帶灰度，計算特異性MMP-7擴增帶灰度與GAPDH擴增帶灰度之比值，即表示MMP-7mRNA相對表達量。

統計學方法：所有數據錄入SAS9.0系統，運用行列表資料X²檢驗進行MMP-7表達的組間差異比較、直線回歸分析進行相關性分析。

結 果

MMP-7在鼻咽癌組織中的表達情況：MMP-7蛋白陽性產物定位于鼻咽癌細胞胞漿，呈淡黃色、棕黃色、棕褐色不同強度染色，腫瘤細胞周圍正常細胞無表達。MMP-7在鼻咽癌組織中的陽性表達率為79.17%(38/48)，慢性鼻咽炎的鼻咽上皮細胞中的陽性表達率為11.11%(2/18)，且均為弱表達。MMP-7在鼻咽癌及慢性鼻咽炎組織中蛋白表達水平的差異比較，結果X²值為26.818，P＜0.001。鼻咽癌原發灶中MMP-7的表達與患者性別、年齡無關，與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移范圍及臨床分期密切相關(P＜0.05)，見表2。

MMP-7 mRNA在鼻咽癌組織中的表達水平：48例鼻咽癌組織中，43例MMP-7呈陽性表達，陽性表達率為89.58%，表達量為0.467±0.199；18例慢性鼻咽炎中，僅有3例表達MMP-7 mRNA，陽性表達率為16.67%，表達量分別為0.112、0.095、0.103。MMP-7在鼻咽癌及慢性鼻咽炎組織中蛋白表達水平的差異比較，X²=32.672，P＜0.001。鼻咽癌原發灶中MMP-7mRNA的表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移范圍及臨床分期密切相關(P＜0.05)，而與患者的性別及年齡無關。詳見表3。

討 論

從組織學的角度分析，鼻咽癌絕大部分(95%以上)屬于惡性度高的未分化或低分化癌，癌細胞易于擴散轉移。據文獻報道，鼻咽癌的頸淋巴結轉移率高達60.3%～81.6%［5］。腫瘤的形成與發展除與細胞自身基因突變所導致的原癌基因激活或抑癌基因失活有關外，還受腫瘤細胞所處微環境變化的影響。細胞外基質(ECM)作為維持細胞微環境內穩態的物質基礎，決定著胞外刺激信號的性質、強度與時空性。近年研究發現，基質金屬蛋白酶家族(MMPs)幾乎可以降解ECM的全部組分，因而ECM的變化受MMPs的調節。MMP-7亦稱基質溶解素(matrilysin)，由于羧基端缺乏類血紅素結合蛋白區，為MMPs中分子量最小的成員。MMP-7主要由纖維母細胞、巨噬細胞、腫瘤細胞分泌，能降解ECM的彈性蛋白、明膠、Ⅳ型膠原纖維、層黏素(LM)、纖維蛋白(FN)等多種成分，為腫瘤細胞擴散提供通道，并通過打破腫瘤細胞間牢固的粘附作用，而促使腫瘤細胞游走，脫離原發瘤而進入周圍組織和血管。由于鼻咽癌原發灶解剖位置深在，并以放療為主要治療手段，因而我們的實驗以T分期作為判斷腫瘤浸潤深度的指標。通過鼻咽癌組織切片的免疫組化實驗，觀察到MMP-7蛋白主要表達于腫瘤細胞，小部分位于腫瘤浸潤邊緣的間質中，并以癌巢擴散前沿(invasive front)的腫瘤細胞表達最為明顯，其在鼻咽癌原發灶中浸潤前沿的癌細胞MMP-7蛋白的表達量明顯高于癌巢中心區域。運用行列表資料X²檢驗的關聯性分析，結果提示MMP-7蛋白表達與鼻咽癌患者性別、年齡無關(X²＝5.324、1.202，P＞0.05)；不同浸潤深度、區域淋巴結轉移范圍和臨床分期的鼻咽癌標本之間MMP-7蛋白表達水平的差異有統計學意義(其相應的X²值為17.012、23.927、20.748，均P＜0.05)，根據各組間數據分布的特點，我們可以推斷MMP-7蛋白表達水平隨著鼻咽癌浸潤深度、淋巴結轉移范圍的增加而升高，與鼻咽癌侵襲轉移能力密切相關；同時較之鼻咽癌早期，進展期有更高的MMP-7蛋白表達。

同時，為了更全面詮釋MMP-7在鼻咽癌中的表達情況，我們還從基因水平檢測MMP-7 mRNA的表達水平。RT-PCR半定量分析的結果表明，鼻咽癌組MMP-7 mRNA的表達陽性率為89.58%，顯著高于慢性鼻咽炎組的16.67%(X²=32.955，P＜0.001)。鼻咽癌組中mRNA的表達水平與患者性別及年齡無關；但是mRNA的表達量隨著T分期的升高呈梯度遞增，經T分期組內兩兩比較的q檢驗，顯示T1的表達量明顯低于 T3、T4，T2 亦低于T4，而T1與T2，T2與T3，T3與T4之間的差異無統計學意義(P>0.05)，這可能是因為相鄰的兩組間腫瘤浸潤深度的差異相對較小，或者該實驗的樣本含量偏少所致。RT-PCR分析的結果還提示MMP-7 mRNA的表達水平隨N分期的升高呈遞增趨勢，各N分

期間的差異有統計學意義(P＜0.05)；并且進展期癌的表達量顯著高于早期癌。RT-PCR實驗中所有鼻咽癌各處理因素的組間比較的差異性與免疫組化的結果相近，說明MMP-7蛋白的表達情況與基因轉錄水平一致，MMP-7與鼻咽癌的侵襲及轉移呈正相關關系。

以上實驗證實MMP-7的表達與鼻咽癌侵襲轉移密切相關，高表達MMP-7的鼻咽癌有更強的惡性能力。因此，MMP-7的表達可以作為預測鼻咽癌惡性程度的生物指標，對于高表達MMP-7的鼻咽癌病例應采取更為積極的治療方案，必要時于術后輔予放化療，并加強隨訪，以減少放療后區域復發和遠處轉移，延長患者生存時間。

參考文獻

1 華貽軍，洪明晃，羅東華，等.406例鼻咽癌患者預后多因素分析.中國腫瘤臨床.2005，32(8)：435-438.

2 宗永生.鼻咽癌組織學診斷.見：閔華慶，潘國英，宗永生，主編.鼻咽癌診治標準.第5版.北京：北京醫科大學、協和醫科大學聯合出版社，1991.

3 劉泰福，徐國鎮.全國鼻咽癌會議紀要.中華放射腫瘤雜志，1992，1(4)：204-209.

4 夏鐵安.腫瘤標志物診斷.見：夏同禮，主編.腫瘤物檢診斷.第1版.北京：人民衛生出版社，2002：98.

5 閔華慶，鼻咽癌.見：張天澤，徐光煒，主編.腫瘤學.第1版.天津：天津科技出版社，1994：1071-1093.