稻瘟菌粗毒素對水稻成熟胚愈傷組織的影響

摘要:以生產上大面積推廣的雜交水稻恢復系蜀恢527和西南科技大學自育優質高產雜交水稻恢復系“2330”為材料，研究目前四川地區的稻瘟優勢菌株稻瘟菌粗毒素對水稻成熟胚愈傷組織誘導#65380;生長和分化的影響。結果表明，在優勢稻瘟菌株A2中，隨著稻瘟菌粗毒素濃度的提高，水稻愈傷組織的誘導率和分化能力顯著降低，“2330”的最低誘導率為16.7%，蜀恢527只有12.5%;愈傷組織的致死率隨毒素濃度的提高而增加，其最高致死率達到100%。在混合毒素培養基中粗毒素濃度為30%的處理選擇效率較合適，但是增加毒素濃度可以進一步提高選擇效果和提高得到抗性突變苗的幾率。

關鍵詞:水稻;稻瘟菌粗毒素;愈傷組織;抗性篩選

中圖分類號:S511;Q813.1+2;S435.111.4+1 文獻標識碼:A 文章編號:0439-8114(2008)08-0855-03

稻瘟菌是半知菌類叢梗孢科梨孢屬的一種真菌，它們侵染水稻葉片并產生α-毗吮羧酸(Picoliinic acid)#65380;稻瘟菌素(Piricularin)#65380;稻瘟醇(Pyriculd)#65380;細交鏈菌酮酸(Tenuazonic acid)#65380;糖肽類物質(Gly copeptide)等毒素，導致稻瘟病的發生。稻瘟病是水稻的三大病害之一。全世界80余個國家均有發生[1]，在我國南北稻區每年均有不同程度的發生，流行年份重病地區一般減產10%~20%，重的達40%~50%，局部田塊甚至顆粒無收[2]。因此，水稻抗稻瘟品種的選育和利用是防治稻瘟病最經濟#65380;最有效#65380;最直接的措施。而利用稻瘟病菌培養液提取粗毒素作為選擇壓，在細胞水平上通過組織培養途徑對水稻抗瘟性進行細胞突變體篩選[3-5]，并把生物技術與常規育種技術相結合培育新的抗病品種的方法，程序簡便#65380;快捷，而且不涉及安全性問題，是抗病育種的一種新方法。

本文采用自行分離的稻瘟菌并提取的稻瘟菌粗毒素為選擇壓，研究其對水稻愈傷組織的影響，旨在為進行抗稻瘟病菌突變體的篩選和選育出適合四川地區的水稻抗病品種提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1水稻材料蜀恢527由西南科技大學水稻研究所提供。“2330”(優質高產雜交水稻恢復系高世代材料)由西南科技大學水稻研究所篩選并提供。稻瘟病發病植株從四川浦江#65380;綿陽等地稻田中采集。

1.1.2稻瘟菌菌株從四川綿陽#65380;安縣等地采集的稻瘟病發病株中分離純化所得。

1.2試驗方法

1.2.1稻瘟菌的分離將感病的穗頸部剪下，用酒精表面消毒后放在濕潤的濾紙上28℃暗培養，待感病穗頸周圍產生菌斑#65380;穗頸上產生菌絲后，將穗頸放在液體培養基(KH2PO4，K2HPO4，MgSO4各0.5 g#8226;L-1酵母浸粉5 g#8226;L-1，葡萄糖20 g#8226;L-1)中28℃暗培養。并不斷純化，得到6個不同菌株，分別命名為A1#65380;A2#65380;B#65380;C#65380;D#65380;E菌株。經過初試，選擇毒株較強的A1#65380;A2菌株進行下一步試驗。

1.2.2稻瘟菌粗毒素的制備將6個不同菌株接種到液體培養基(KH2PO4，K2HPO4，MgSO4各0.5 g#8226;L-1，酵母浸粉5 g#8226;L-1，葡萄糖20 g#8226;L-1)中25℃條件下振蕩培養20 d，3層紗布過濾出菌絲球，將菌絲球充分研磨后倒回培養液26℃繼續振蕩30 min，

2 000 r#8226;min-1離心20 min，取上清(無菌絲球的直接離心)，使得到稻瘟菌粗毒素。

1.2.3水稻成熟胚愈傷組織的誘導選取子粒飽滿的“2330”和蜀恢527(CK)種子40粒，剝去穎殼后，在70%的酒精溶液中浸泡30 s，用無菌水沖洗后加入0.1%的升汞溶液消毒7~10 min，然后用無菌水沖洗3~4次。接種到MS附加A1和A2菌株0(CK)#65380;10%(A1-1或A2-1)#65380;20%(A1-2或A2-2)#65380;30%(A1-3或A2-3)#65380;40%(A1-4或A2-4)#65380;50%(A1-5或A2-5)(V/V)粗毒素提取液的愈傷組織誘導培養基上，在25℃條件下暗培養。

1.2.4愈傷組織的繼代培養及分化為提高“2330”對四川地區稻瘟病的廣譜抗性，將“2330”愈傷組織轉到含0(CK)#65380;10%#65380;30%#65380;50%(V/V)混合粗毒素提取液(各毒素等比例混合)的愈傷組織繼代培養基中進一步篩選培養并增殖，將長勢一致的愈傷組織轉接入含相同毒素得分化培養基。在7 500 lx光照14 h#8226;d-1，25℃下培養。

2結果與分析

2.1稻瘟菌粗提物對水稻愈傷組織誘導率的影響

通過稻瘟菌粗毒素對水稻種子的發芽抑制試驗對分離得到的菌株進行毒力鑒定，用毒力較強的A1#65380;A2稻瘟病菌株提取的粗毒素對水稻成熟胚愈傷組織誘導抑制試驗，培養7 d后觀察統計稻瘟病菌粗毒素對水稻成熟胚愈傷組織誘導率的影響，結果見表1。不同水稻品種與稻瘟病菌粗毒素之間的作用存在著基因型間的差異，且不同的稻瘟菌小種對水稻成熟胚愈傷組織誘導的抑制作用不同。

2.1.1不同稻瘟菌株對水稻成熟胚愈傷組織的影響在不同濃度條件下，稻瘟菌粗毒素對水稻成熟胚愈傷組織的誘導率隨粗毒素濃度的增加而提高。A1毒素在10%處理時對愈傷組織的誘導率幾乎沒有影響;當濃度達到50%時，A1對“2330”和蜀恢527愈傷組織的誘導均有明顯的抑制作用，其誘導率分別為22.5%和25.0%。A2菌株在中高濃度(A2-3~A2-5)處理時對兩種材料愈傷組織誘導均有明顯的抑制效應，當粗毒素濃度達到50%時，“2330”和蜀恢527的愈傷誘導率分別為16.7%和12.5%，較對照分別下降66.6和71.5個百分點。較A1處理的抑制能力分別提高5.8和12.5個百分點。且A2處理條件下誘導出來的愈傷組織多數又變黑色，幾天后即會死亡(圖1#65380;圖2)。因此稻瘟菌小種A2相對于A1對兩種水稻成熟胚愈傷組織誘導的抑制力較強。

2.1.2不同材料對稻瘟菌A1，A2粗毒素的反應在不同菌株及濃度下“2330”和蜀恢527間愈傷組織的誘導率相差不大，均隨稻瘟菌粗毒素濃度的增加而減小。但是在愈傷組織繼續培養過程中不同親本材料的愈傷組織對兩種粗毒素的反應相差較大。在A1菌株毒素的處理條件下，“2330”愈傷組織幾乎全部存活，說明親本“2330”抗A1菌株的能力較強;蜀恢527在A1菌株毒素處理下，其最高致死率仍達到50%，在A2毒素處理下最高達到100%。

2.2稻瘟菌混合粗毒素對“2330”愈傷組織生長和分化的影響

為使“2330”對稻瘟病具有廣譜抗性，將誘導得到的“2330”愈傷轉接入含混合毒素(A1，A2，C，D等毒素以等比例混合)的分化培養基中培養。其生長和分化情況見表2#65380;表3。

2.2.1稻瘟菌混合粗毒素對“2330”愈傷組織生長的影響由表3可見，混合粗毒素對“2330”愈傷組織具有嚴重的傷害作用，隨粗毒素濃度增加其致死率提高，當濃度達到50%時，致死率為62.50%。在低濃度處理下“2330”愈傷組織的致死率不高，但仍顯著大于對照處理;中高濃度處理下的致死率差異不大，都在60%左右。但中高濃度下的愈傷組織長勢差異明顯，高濃度下存活的愈傷組織多為黃褐色，組織塊增長較小或不增大，只有少數組織塊的顏色新鮮且出現增殖。因此推斷黃褐色長勢較弱愈傷組織可能是對混合粗毒素壓力生理性適應的愈傷組織;而長勢新鮮的組織有可能是篩選得到的抗性愈傷組織。

2.2.2稻瘟菌混合粗毒素對“2330”愈傷組織分化的影響在愈傷組織的分化出苗誘導中，隨著毒素濃度的升高，“2330”愈傷組織繼續死亡數增加，分化出苗數也呈現下降的趨勢，在高濃度下，分化率極低，只得到7株水稻苗，其分化率只有10.94%，顯著低于對照處理及其他各濃度水平下的愈傷組織分化率;不同處理條件下的出苗總數也隨混合粗毒素濃度的增加而下降，在高濃度處理條件下，從每個組織塊上分化生長出的水稻組培苗多為單株，中低濃度條件下在同一組織塊上的簇生苗較多

(圖3)。單生苗可能是在高濃度的繼續處理下產生的個別抗性突變細胞分化而來，進一步推斷篩選所得到的苗為抗性突變苗。因此高濃度處理條件下雖然只得到較少的分化苗，但選擇效果應高于其他處理，對突變體的篩選效率相對較高。

3討論

稻瘟菌粗提液處理對水稻組織培養能產生明顯的作用。在高濃度稻瘟菌毒素條件下愈傷組織的誘導率及成活率都迅速下降，甚至不產生愈傷組織或愈傷組織全部褐化，只是在某一塊微褐化的愈傷組織上偶爾產生生長旺盛的白色愈傷。推測這是在高選擇壓條件下產生的抗稻瘟病突變體。培養基中毒素的濃度處理以30%效果最合適，可以篩選得到較多的抗性愈傷。這與前人結果相同[6];如果有足夠多的愈傷組織可以使用較大的毒素濃度，以提高選擇效果。在本試驗條件下，抗性苗的繼代增值及生根培養過程中，得到的抗性苗仍有死亡現象(圖4)，其原因可能是在添加混合毒素的分化培養基上同時分化出了非抗性幼苗，在毒素長期作用下致死的緣故。

不同的水稻品種在毒素作用下進行組織培養時存在著差異性，本研究所用兩個親本材料均為非抗病材料，但仍存在著較大差異性，因此在進行抗稻瘟病篩選時所選用的毒素的濃度應和材料的抗性相對應，對不同的品種應選用不同濃度的稻瘟菌毒素作為選擇壓。由于在做實驗時使用的粗毒素是四川地區危害較嚴重的兩種稻瘟病菌粗毒素的混合液，所以其產生的突變體可能只抗其中一種，有可能具有多抗性。對抗性苗的田間抗性鑒定及對不同稻瘟病生理小種的反應需以后做進一步的鑒定。我們將繼續研究其抗性苗在田間的表現，以獲得新的抗病種質資源，并實現其在生產中的應用。

參考文獻:

[1]任羽，王效寧.水稻抗稻瘟病育種研究進展[J].海南農業科技，2004(2):27-29.

[2]孫國昌，杜新法，陶榮祥，等.水稻稻瘟病防治策略和21世紀研究展望[J].植物病理學報，1998，28(4):289-298.

[3]何月秋，唐文華.水稻抗稻瘟病突遺傳研究進展[J].云南農業大學學報，2002，15(4):121.

[4]陳啟峰，陳璋，王金陵.運用致病毒素篩選抗稻瘟病細胞突變體[J].遺傳學報，1993，20(4):340-347.

[5]趙海巖，鄭文靜.水稻抗稻瘟病變異體離體篩選及在育種中應用[J].遼寧農業科學，2001(3):21-25.

[6]高立宏，袁業琴，魏健.稻瘟病菌粗毒素對水稻幼胚愈傷組織的影響及抗性篩選[J].長春師范學院學報(自然科學版)，2005，25(5):97-99.