紅法夫酵母的分子生物學研究進展

摘要:紅法夫酵母是生物合成以蝦青素為主要色素的惟一酵母，綜述了紅法夫酵母蝦青素生物合成途徑相關(guān)基因#65380;基因工程等方面的研究進展。

關(guān)鍵詞:紅法夫酵母;分子生物學;基因;基因工程

中圖分類號:TQ926.4;Q7 文獻標識碼:A 文章編號:0439-8114(2008)08-0964-05

紅法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)是可以利用多種碳源如葡萄糖#65380;蔗糖等生物合成以蝦青素為主要色素的的惟一酵母[1]。蝦青素(3，3’-二羥基-β，β’-胡蘿卜素-4，4’-二酮)具有優(yōu)良的色素沉積作用并能促進動物發(fā)育，而且由于其超強的抗氧化活性及較強抗腫瘤活性而日益受到研究者的關(guān)注[2-4]。

然而相對于生產(chǎn)蝦青素的細菌和藻類分子生物學研究成果，紅法夫酵母的分子生物學方面的研究并不多見。Verdoes等[5]關(guān)于紅法夫酵母番茄紅素脫氫酶基因的研究是第一個報道的紅法夫酵母蝦青素合成的基因，本文綜述了紅法夫酵母分子生物學方面的研究進展。

1 紅法夫酵母蝦青素生物合成途徑中相關(guān)酶的分子生物學研究

紅法夫酵母蝦青素生物合成途徑已經(jīng)基本明了，而相關(guān)酶及其編碼基因了解并不多(如表1和圖1所示)。紅法夫酵母產(chǎn)生的蝦青素是源于甲羥戊酸(mevalonte，MVA)途徑，雙環(huán)途徑是絕大多數(shù)紅法夫酵母菌株蝦青素生物合成途徑，在此途徑中8分子的IPP縮合生成八氫番茄紅素，經(jīng)過4個脫氫和兩個環(huán)化反應后生成β-胡蘿卜素，經(jīng)過氧化之后生成終產(chǎn)物蝦青素。

Verdoes等[5]采用Escherichia coli異源互補法分離到紅法夫酵母第1個類胡蘿卜素合成基因并命名為crt I，該基因編碼八氫番茄紅素脫氫酶。其編碼區(qū)含有11個內(nèi)含子，氨基酸序列顯示它與細菌和真核生物有重要的同源性，特別是與真菌來源的同源性更高。將整合有來源于Erwinia uredovora#65380;編碼geranylgeranyl diphosphate synthase(GGDP合成酶)基因和phytoene synthase(八氫番茄紅素合成酶)基因的質(zhì)粒，與紅法夫酵母中編碼八氫番茄紅素脫氫酶的cDNA一起導入E.coli，結(jié)果在陽性轉(zhuǎn)化子中觀察到番茄紅素的積累。此結(jié)果證明紅法夫酵母四步脫氫反應中，八氫番茄紅素轉(zhuǎn)化成番茄紅素的反應是crt I基因編碼酶催化的。

crt YB是紅法夫酵母中一種類胡蘿卜素生物合成酶的編碼基因，Verdoes等[6]在基因修飾過的類胡蘿卜素合成的E. coli菌株中通過功能互補的方法對此基因進行了分離。在含有不同類胡蘿卜素基因的E. coli菌株中進行了表達，表明crt YB編碼一個雙功能的酶蛋白，此酶既催化GGDP合成八氫番茄紅素合成也催化番茄紅素合成β-胡蘿卜素。通過與其他編碼八氫番茄紅素合成酶進行序列比對以及在E. coli菌株中進行crt YB基因不同示差分析的互補研究，編碼八氫番茄紅素合成和番茄紅素環(huán)化的結(jié)構(gòu)域定位于蛋白上[5-10]。

2 紅法夫酵母基因工程菌種改良研究

相對于細菌#65380;藻類的蝦青素基因研究成果，紅法夫酵母蝦青素生物合成途徑中相關(guān)基因目前研究甚少。Verdoes等[5]關(guān)于紅法夫酵母番茄紅素脫氫酶基因的研究是第1個報道的紅法夫酵母蝦青素合成的基因，研究結(jié)果認為紅法夫酵母細胞的番茄紅素脫氫酶基因含有11個內(nèi)含子，酶的還原性末端氨基酸序列與細菌#65380;霉菌明顯存在一致性。用含有此酶的cDNA與歐氏菌的GGDP基因#65380;番茄紅素合成酶基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，轉(zhuǎn)化子最終合成番茄紅素。

Wery等[11]建立并優(yōu)化了用于紅法夫酵母分子生物學的轉(zhuǎn)化體系。紅法夫酵母的肌動蛋白和gpd編碼基因的啟動子用于表達轉(zhuǎn)座子Tn5的卡拉霉素抗性基因。為了將基因穩(wěn)定地整合到基因組并提高整合頻率，在轉(zhuǎn)化載體上引入了一部分紅法夫酵母核糖體DNA，在優(yōu)化條件下轉(zhuǎn)化效率可達每μg質(zhì)粒DNA1000轉(zhuǎn)化子。

分離紅法夫酵母類胡蘿卜素生物合成基因的可能策略是應用異源互補技術(shù)[12]。E. coli不能合成類胡蘿卜素，但是轉(zhuǎn)入含有一系列細菌Erwinia uredovora胡蘿卜素合成基因質(zhì)粒后，當引入6個完整crt基因組后可產(chǎn)生桔黃色類胡蘿卜素玉米黃質(zhì)-β-二糖苷[13]。Misawa等[14]建立了完整的質(zhì)粒體系，但其中一個或多個E. uredovora的crt基因是不活躍的。這些菌株可以用作篩選紅法夫酵母cDNA文庫的宿主，導入E. coli后可以產(chǎn)生有顏色的菌落，這些陽性克隆子可以很容易的通過肉眼挑選出來。基于紅法夫酵母和E. coli類胡蘿卜素含量的分析，表明兩菌株含有相同的酶。通過這種方法，X. dendrorhous中編碼GGDP合成酶的基因crt E，編碼八氫番茄紅素合成酶的基因crt YB，八氫番茄紅素脫氫酶crt I以及番茄紅素環(huán)化酶crt YB都成功的得到分離[5-10]。讓人奇怪的是crt YB基因可以在蝦青素生物合成途徑中催化兩個不連續(xù)的轉(zhuǎn)化反應。crt YB基因編碼的酶催化兩個不同的反應:兩分子的GGDP生成八氫番茄紅素和將線性的類胡蘿卜素番茄紅素環(huán)化為β-胡蘿卜素，這個基因編碼兩種不同功能的類胡蘿卜素生物合成相關(guān)酶的現(xiàn)象在其他產(chǎn)類胡蘿卜素的真菌中也存在。

Verdoes等[15]采用產(chǎn)生番茄紅素的E. coli菌株XL-blueMRF’(pACCRT-EIB)來篩選X. dendrorhous的cDNA，觀察到了從淡紅色到深紅色的菌落，相關(guān)的氨基酸分析表明其多肽序列與不產(chǎn)類胡蘿卜素酵母的IPP-DMAPP異構(gòu)酶有著明顯的同源性。將X. dendrorhou的idi基因?qū)氘a(chǎn)類胡蘿卜素的E. coli菌株，其類胡蘿卜素產(chǎn)量可以提高1.3~3倍。同樣IPP異構(gòu)酶活性是產(chǎn)類胡蘿卜素的E. coli菌株一個限速步驟。X. dendrorhou中IPP是通過甲羥戊酸途徑合成的，IPP異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化IPP為DMAPP，DMAPP參與隨后的二烯基轉(zhuǎn)化反應中。然而同Saccharomyces cerevisiae一樣，X. dendrorhou的idi基因可能是必須的[16]。而在E. coli菌株中情況就完全不同了，IPP是通過非甲羥戊酸途徑產(chǎn)生的(或通過丙酮酸途徑或3-磷酸-磷酸甘油醛途徑)，此外E. coli菌株的idi基因并不是必要的[17]，DMAPP可以用其他的IPP異構(gòu)酶或其他未知合成IPP的前體合成[18]。可見E. coli菌株中類胡蘿卜素的合成與X. dendrorhou在生理學上是不同的，表明X. dendrorhou中與異戊二烯合成相關(guān)的IPP異構(gòu)酶的地位和調(diào)控是不同的。

采用異源互補法獲得了類胡蘿卜素合成基因，并在E. coli進行克隆。如圖2，1為E. coli(質(zhì)粒為pACCRT△crtE)中含有E. uredovora的玉米黃質(zhì)生物合成途徑，但其中crt E基因被阻斷，結(jié)果產(chǎn)生白色菌株，此菌株可用于篩選紅法夫酵母cDNA文庫。2為E. coli中(質(zhì)粒為pACCRT△crtE/pPRcrtE)在含有crt E基因cDNA的時得到的黃橙色克隆子，但大多數(shù)是白色菌株。3為野生型紅法夫酵母CBS 6938菌株產(chǎn)生的類胡蘿卜素，4為野生型紅法夫酵母CBS 6938菌株中crt E基因被阻斷時的情形。5為野生型紅法夫酵母CBS 6938菌株中crt YB基因過度表達時的情形，6為野生型紅法夫酵母CBS 6938菌株中crt I基因過度表達時的情形。7為野生型紅法夫酵母CBS 6938菌株的突變株P(guān)R-1-104，該菌株積累Beta-carotene。8為野生型紅法夫酵母CBS 6938菌株的突變株P(guān)R-1-104，其crt I基因過度表達時的情形。

3 紅法夫酵母其他的分子生物學研究

Cifuentes等[19]采用脈沖場凝膠電泳分析了紅法夫酵母野生型與一種產(chǎn)蝦青素及兩種β-胡蘿卜素不同菌株的染色體成分差異。結(jié)果表明，野生型紅法夫酵母有9條染色體條帶，基因組大小在0.35~2.5 Mb之間，表明染色體組大小為25 Mb，經(jīng)過探針雜交得到了紅法夫酵母基因組結(jié)構(gòu)的信息。Cifuentes克隆并定位了染色體上編碼延長因子α的不同DNA序列，重復DNA序列的BamHI片段長度為7.6 kb，以及一個隨機選擇片段(命名為locus R2)。

Wery等[20]建立了一種將高拷貝穩(wěn)定整合到紅法夫酵母rDNA的轉(zhuǎn)化體系。他構(gòu)建了一種Tn5轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，含有編碼卡拉霉素抗性基因(kmR，它與紅法夫酵母的肌動蛋白編碼基因5’-末端連接)。此質(zhì)粒受到紅法夫酵母肌動蛋白啟動子的操縱，對G418(Geneticin)有抗性，質(zhì)粒中還含有18S rDNA的一部分rRNA片段。

Verdoes等[21]從紅法夫酵母CBS6938基因組文庫中分離得到編碼三磷酸甘油醛脫氫酶(GPD; EC1.2.1.12)的基因(gpd)。不像其他真核生物的gpd基因是多拷貝的，gpd基因在紅法夫酵母中是單拷貝的。該基因編碼的全部核苷酸序列及其側(cè)面的非編碼區(qū)序列已闡明。gpd基因核苷酸序列預計含6個內(nèi)含子，編碼399氨基酸殘基的多肽鏈。紅法夫酵母gpd基因的密碼子使用頻率與其他酵母比較明顯不同，有很大偏差。與不同酵母和擔子菌類gpd基因序列系統(tǒng)發(fā)生比較分析表明紅法夫酵母gpd基因呈簇狀。

Visser等[22]分離了來源于紅法夫酵母編碼環(huán)氧化水解酶的基因(EPH1)。該基因序列有8個內(nèi)含子的1 236 bp的開放閱讀框，編碼411個氨基酸肽鏈，分子大小為46.2 kDa。其氨基酸序列與微EH相似，屬于α/β水解酶折疊家族。EPH1基因在實驗室條件富集培養(yǎng)基下對X. dendrorhous生長并不是完全必要的。EPH1編碼cDNxA在E. coli中功能性表達，在靜止期細胞中觀察到其特殊活性有六倍的增加。epoxides 1，2-epoxyhexane和1-methylcyclohexene oxide作為天然和重組Eph1的底物。分離和描述X. dendrorhous EH編碼基因是研究酵母基于EH環(huán)氧化物生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的必要步驟。

Verdoes等[23]在紅法夫酵母的cDNA文庫隨機抽取96個序列，從中發(fā)現(xiàn)了10個奇特的細胞質(zhì)核醣體蛋白質(zhì)(RP)，它們都是通過完整編碼克隆出來的。其氨基酸序列與真核細胞生物如哺乳動物#65380;真菌以及植物有顯著的同源性。一些RP編碼的cDNA出現(xiàn)多次，但是通過Southern blot分析表明它們都由一個單一基因編碼的。這10個全長cDNA的核苷序列可以用來研究基因X. dendrorhous的密碼子。

4 展望

蝦青素是一種具有優(yōu)良的色素沉積作用#65380;能促進動物發(fā)育#65380;具有超強抗氧化活性及較強抗腫瘤活性的類胡蘿卜素，紅法夫酵母是惟一能夠利用多種廉價碳源生物合成以蝦青素為主要色素的的酵母，對其蝦青素合成相關(guān)途徑關(guān)鍵酶基因的研究對于明確蝦青素生物合成的機理和促進蝦青素生物合成并進行基因工程手段改造以得到適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的高產(chǎn)菌株都具有重要的理論意義和應用價值。

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