缺失外殼蛋白羧端１５５－１５８序列對ＴＭＶ侵染性的影響

摘要:對野生型TMV-U1的外殼蛋白羧端進行缺失突變，觀察到外殼蛋白羧端序列缺失4個氨基酸(即外殼蛋白保留154個氨基酸)的TMV154TAG能較強地系統侵染煙草，并高水平表達外殼蛋白，經過二次轉接新煙草植株仍保持較強的系統侵染狀況，復制完整病毒粒子。結果說明外殼蛋白羧端序列4個氨基酸序列的缺失對煙草花葉病毒感染和復制無嚴重影響，對利用外殼蛋白羧端缺失型病毒載體表達外源多肽技術具有一定的應用價值。

關鍵詞:煙草花葉病毒;外殼蛋白;羧端缺失;侵染性;外源肽

中圖分類號:S572;S432.4+1;Q503 文獻標識碼:A 文章編號:0439-8114(2008)08-0863-02

煙草花葉病毒屬于煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)，其基因組是帶有帽子結構的正義單鏈RNA，全長6 395nt。TMV至少編碼了4種蛋白質:126/183ku的兩種復制酶#65380;30ku的運動蛋白(movement protein，MP)和17.5ku的外殼蛋白(coat protein，CP)[1]。TMV系統感染敏感性煙草后，CP表達量可達到被感染煙草總蛋白的7%，CP亞基含有158個氨基酸，由4個α螺旋組成，蛋白的N端和C端暴露在外部[2]，因此常利用病毒CP基因融合技術表達可產生大量的融合外源肽，并且展示在TMV的外側。基于江陸斌利用TMV載體表達外源肽方面的重要發現[3]和表達外源長肽的需要，前期對系列缺失型TMV病毒侵染的研究[4]，本試驗旨在通過對外殼蛋白缺失4個氨基酸的TMV154TAG侵染情況進行重點研究，來推動缺失型TMV病毒載體表達外源多肽的應用研究，于是對已構建的CP羧端缺失型TMV病毒載體，經過體外轉錄后感染Nicotiana tabaccum cv. Samsun nn，并且經二次轉接新煙草植株，就感染情況進行不同層面的觀察和檢測。

1材料與方法

1.1試驗材料

酶與試劑所用工具酶購自Fermentas公司和上海生物工程技術有限公司，試劑購自國藥集團上海分公司，質粒pTMV154TAG由本實驗室構建[4]。供試煙草Nicotiana tabaccum cv. Samsun nn生長在溫室中，人工光照12 h#8226;d-1。培養4~6周時用于病毒接種。在接種前2~3 d，移至溫室。

1.2試驗方法

1.2.1體外轉錄與接種對pTMV154TAG線性化，并體外轉錄得到突變病毒TMV154TAG的全長RNA[5]，以野生型RNA為對照，用機械摩擦接種法分別將RNA接種于煙草葉片上;并使用已感染病毒的煙草頂葉研磨液第2次侵染新苗。

1.2.2RT-PCR檢測提取第2次侵染新苗后新生頂葉的總RNA為模板[6]，用引物SQ3(+)[4]和Pst (-)[4]進行RT-PCR擴增，擴增產物1kb用于測序。 1.2.3SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)制備感染煙草葉片的可溶性蛋白粗提液，實施15% SDS-PAGE[5]。

1.2.4突變病毒粒子純化及電鏡檢測參照Aileen等[7]的方法，提取并純化病毒粒子，以供電鏡JEM-200CX(日本JOEL)觀察。

2結果與分析

2.1RT-PCR對病毒RNA的檢測

為檢測TMV154TAG在煙草體內的長距離遷移和復制情況，對新葉進行了病毒RNA和已感染頂葉研磨液二次感染煙草后新葉的病毒RNA在不同的時段進行了RT-PCR檢測，結果顯示，TMV154TAG的基因組RNA在所有接種的煙草新葉里都能檢測到(圖1)。對lane6所示的擴增片段(約1kb)純化測序表明，TMV154TAG進行長距離遷移并能正確穩定地復制，無回復突變。

2.2二次感染新葉外殼蛋白SDS-PAGE結果

為檢測CP羧端缺失對病毒在新葉外殼蛋白表達的影響，以及轉接感染有無衰弱的變化，進行SDS-PAGE蛋白電泳檢測(圖2)，前期CP蛋白印跡雜交試驗[4]已經確認缺失型CP正確表達。SDS-PAGE結果顯示，不論TMV154TAG初次感染煙草，還是利用已感染煙草頂葉研磨液第二次侵染新苗，都能在頂葉中檢測到大小約17 ku的CP，只是其電泳遷移率較野生型CP稍快，通過內參Rubisco大亞基表達情況，可以觀察到二次感染新葉中CP持續的表達量與野生型相當。

2.3感染后新生葉中病毒粒子的電鏡觀察結果

為了檢測CP的羧端缺失對于TMV是否能形成完整粒子并穩定傳代，對初次感染煙草的新葉(B)以及二次感染的新葉(C)分別提取純化病毒粒子后進行透射電鏡觀察(圖3)，結果都發現TMV154TAG完整粒子，外觀形態都與野生型相似(A)，說明TMV154TAG能完好復制并穩定傳代。

3討論

通過X射線單晶衍射技術對CP觀察，發現CP的最后4個氨基酸對于整個蛋白三維結構的作用不明顯[8]，本試驗中，初染和二次轉接侵染檢測以大量數據確切表明，煙草花葉病毒TMV-U1株系的CP羧端缺失155-158的4位氨基酸時，TMV154TAG能對煙草產生較強的系統感染，新葉出現與野生型相似的綠色花斑，并大量表達外殼蛋白，所產生的病毒顆粒的形態與野生型病毒并無明顯差別。此外，感染后的新生葉粗提物二次感染新苗后，其病毒的基因組RNA和CP均能夠在二次感染的新生葉中檢測到高表達的外殼蛋白表達水平，并能穩定復制完整病毒粒子，無回復突變，這都說明TMV-U1株系CP羧端的4位氨基酸缺失并不影響TMV的基因組復制#65380;包裝#65380;感染和長距離運輸(系統感染)。此現象出現也引發我們對外殼蛋白羧端序列功用性的思考，在不影響TMV病毒的復制#65380;系統感染方面之外，4位氨基酸究竟對于古老的煙草花葉病毒有何生物學的意義。

基于對155-158序列缺失影響的認識，對上游氨基酸作了更深入研究[4]。現在利用的TMV病毒載體表達外源肽，多選擇在CP的羧端154與155之間插入外源序列，且保留羧端的4個氨基酸采取融合的方式表達抗原短肽[9]，使插入的外源序列暴露于病毒粒子外部，對于后期的純化帶來不便。根據表達和純化外源肽的技術需要[7]，本結果將推動缺失型TMV病毒載體表達外源多肽的應用研究，且無需保留病毒CP羧端序列，并高效表達外源多肽。

參考文獻:

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