產(chǎn)堿性纖維素酶真菌的篩選鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究

摘要:經(jīng)過初篩和復(fù)篩從從堿性土樣中分離出的7株產(chǎn)纖維素酶的真菌中獲得1株能夠產(chǎn)堿性纖維素酶的絲狀真菌t42。經(jīng)18S rRNA基因序列分析和，確定該菌株為鐮刀霉菌(Fusarium sp)。酶學(xué)性質(zhì)初步研究顯示t42的CMC酶最適作用pH值為7.5，在pH值7.0~8.5的范圍內(nèi)具較高的穩(wěn)定性;反應(yīng)溫度以50℃左右為宜，且在55℃以下具有較高的溫度穩(wěn)定性;Mg2+#65380;Mn2+和Zn2+對酶反應(yīng)有促進(jìn)作用，Pb2+和Cu2+對酶反應(yīng)有抑制作用。

關(guān)鍵詞:堿性纖維素酶;真菌;篩選鑒定;酶學(xué)性質(zhì)

中圖分類號(hào): 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2008)08-0899-02

纖維素酶是由多種水解酶組成的一個(gè)復(fù)雜酶系，主要來自于真菌和細(xì)菌。堿性纖維素酶在堿性條件下具有內(nèi)切β-1，4葡萄糖苷酶活力，因而在洗滌劑#65380;紡織#65380;廢水處理和制漿造紙工業(yè)等行業(yè)中有更好的應(yīng)用前景[1-3]。但目前研究較多的是木霉(Trichoderma)#65380;曲霉(Aspergillus)屬等真菌產(chǎn)生的酸性纖維素酶。酸性纖維素酶在堿性條件下酶活性較低或根本沒有活性#65380;穩(wěn)定性較差#65380;pH值適應(yīng)范圍窄等，這極大限制了纖維素酶在這些行業(yè)中的應(yīng)用。因此篩選產(chǎn)酶性能好的產(chǎn)堿性纖維素酶的菌株有較大的實(shí)際意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

堿性土壤#65380;朽木取自湖北咸寧天化紡業(yè)有限公司附近。羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基(CMC-Na培養(yǎng)

基)[4]:NaCl 6 g，MgSO4#8226;7 H2O 0.1 g，KH2PO4 0.5 g，CaCl2 0.1 g，K2HPO4 2.0 g，CMC-Na 15 g，(NH4)2SO4 2.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值8~8.5;固體培養(yǎng)基加1.5%瓊脂。分離培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選

1)固體培養(yǎng)初篩 將采集到的堿性土壤#65380;朽木等經(jīng)無菌水洗滌后，吸取上清液作一系列梯度稀釋，將稀釋液涂布在選擇培養(yǎng)基——羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)平板上(用前加入適量抗生素來抑制細(xì)菌生長)，28℃倒置恒溫培養(yǎng);分離篩選生長旺盛，并在剛果紅染色#65380;NaCl脫色后可以觀察到菌落周圍有明顯透明水解圈的菌株進(jìn)行下一步研究[5]。

2)搖瓶復(fù)篩 將篩選到的菌種由平板接到50 mL(250 mL三角瓶)液體培養(yǎng)基中，于28℃#65380;210 r#8226;min-1下培養(yǎng)24 h，制成種子液。然后按5%的接種量將種子液加到50 mL(250 mL三角瓶)相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，于28℃#65380;210 r#8226;min-1條件下培養(yǎng)48 h，將發(fā)酵的粗酶液在不同pH條件下測定酶活，選擇酶活反應(yīng)的最適pH偏堿性的菌株保藏備用。

1.2.2 纖維素酶活力的測定 取1.5 mL 0.05 mol#8226;L-1醋酸緩沖液配制的1.0%羧甲基纖維素鈉溶液，加入0.1 mL經(jīng)5 000 r#8226;min-1離心10 min所得的發(fā)酵液上清液，50℃反應(yīng)20 min。用DNS法測定反應(yīng)后還原糖(葡萄糖)含量，做空白對照扣除本底。酶活定義為上述條件下，1 mL發(fā)酵液1 min催化底物生成1 μmol葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活力單位“IU”。

1.2.3 菌種鑒定 采用18S rRNA基因分析[5-7]:提取絲狀真菌的DNA，用真菌核糖體DNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)通用引物(5′—TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC—3′和5′—GGA GAT AGT CGT AAC AAG G—3′)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后經(jīng)北京三博志遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選鑒定

取自堿性土壤#65380;朽木的23份樣本中經(jīng)稀釋涂布平板分離到能在pH值7.0~8.0的CMC-Na平板上生長的透明圈直徑較大的真菌7株。搖瓶復(fù)篩，其中1株初始編號(hào)為t42的菌株在堿性條件下生長較快，最適酶反應(yīng)pH值(內(nèi)切酶活力在pH值7.5左右達(dá)最高)及菌株生長的耐堿性都要高于其他產(chǎn)纖維素酶的真菌(表1)，因而選用此菌株作進(jìn)一步的研究。該菌株經(jīng)北京三博志遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司測序，初步確定該菌株為鐮刀霉菌(Fusarium sp)。

2.2 酶學(xué)性質(zhì)的初步研究

2.2.1 酶反應(yīng)的最適pH值 將t42的CMC酶液分別置于pH值5.5#65380;6.0#65380;6.5#65380;7.0#65380;7.5#65380;8.0#65380;8.5#65380;9.0#65380;9.5的HAC-NaAC緩沖液中測定CMC酶活力(圖1)。結(jié)果表明，酶反應(yīng)的最適pH值為7.5左右，且在pH值8.5也具有較高的酶活性。

2.2.2 酶的pH穩(wěn)定性 將t42的CMC酶液分別置于不同pH值的HAC-NaAC緩沖液中，室溫保持1 h后，按常規(guī)方法測定剩余酶活力(圖2)，結(jié)果顯示，t42的酶液在pH值7.0~8.5范圍內(nèi)，剩余酶活力可保持80%以上。

2.2.3 酶反應(yīng)的最適溫度 取t42的CMC酶液置于pH值7.5的HAC-NaAC緩沖液中，分別在30℃#65380;35℃#65380;40℃#65380;45℃#65380;50℃#65380;55℃#65380;60℃#65380;65℃#65380;70℃#65380;75℃#65380;80℃的溫度條件下反應(yīng)，測定酶活力(圖3)。結(jié)果表明，該酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，在40~55℃間具有相對較高的酶活力。

2.2.4 酶的熱穩(wěn)定性 將t42的CMC酶液在30℃#65380;35℃#65380;40℃#65380;45℃#65380;50℃#65380;55℃#65380;60℃#65380;65℃#65380;70℃#65380;75℃#65380;80℃各溫度下保溫1h后，按常規(guī)方法測定剩余酶活力(圖4)，結(jié)果表明，該酶在經(jīng)30~55℃溫度范圍內(nèi)，酶活性可保持原活力的80%以上。說明該酶在55℃以下的具有較高的溫度穩(wěn)定性。

2.2.5 金屬離子對酶活性的影響 在酶反應(yīng)體系中加入不同的金屬離子(0.01 mol#8226;L-1)，測定CMC酶活力(圖5)，結(jié)果顯示，Mg2+#65380;Mn2+和Zn2+對酶反應(yīng)有促進(jìn)作用，Pb2+和Cu2+對酶反應(yīng)有抑制作用。

3 小結(jié)

從堿性土壤樣品中篩選到1株能夠產(chǎn)堿性纖維素酶的絲狀真菌菌株t42，經(jīng)18S rRNA基因分析，初步確定該菌株為鐮刀霉菌(Fusarium sp)。研究t42的粗酶液的CMC酶的酶學(xué)性質(zhì)表明，其最適作用pH分別為7.5，在pH7~8.5的范圍內(nèi)具較高的穩(wěn)定性;反應(yīng)溫度以50℃左右為宜，且在50℃以下具有較高的溫度穩(wěn)定性。Mg2+#65380;Mn2+和Zn2+對酶反應(yīng)有促進(jìn)作用，Pb2+和Cu2+對酶反應(yīng)有抑制作用。該菌株產(chǎn)酶活力高#65380;穩(wěn)定性好，具較強(qiáng)的耐堿性。這些特性還未見報(bào)道，因而在洗滌劑#65380;紡織#65380;廢水處理和制漿造紙工業(yè)等行業(yè)中有較好的應(yīng)用前景。

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