苧麻內生真菌的分離鑒定及其活性研究

摘要:分別于春夏兩季用不同濃度的NaClO處理苧麻的不同部位后，對分離出來的內生真菌的數量和種類進行分析。結果發現，NaClO濃度的改變對所分離內生真菌的種類無影響，但對菌株生長有顯著影響。用NaClO作消毒試劑的最佳處理濃度和時間分別為2.5%和10~15 min，篩選得到了兩株有較強抗菌活性的曲霉。

關鍵詞:苧麻;內生真菌;NaClO

中圖分類號:Q93 文獻標識碼:B 文章編號:0439-8114(2008)08-0920-03

內生真菌(Endophytic fungi)是一大類未被充分認識的真菌，它泛指生活在健康的植物體內不引起任何可見的病害癥狀的所有真菌[1]。內生真菌能夠參與植物活性成分的合成，或者參與植物次生代謝產物的轉化。內生真菌的研究對于其與植物共生生態，天然產物與藥物的開發等有著重要的意義[2]。

苧麻(Boehmeria mvea Gaud.)為蕁麻科(Urticaceae)苧麻屬，是一種優良的紡織原料，被公認為“天然纖維之王”。本文對苧麻用不同濃度NaClO處理后進行內生真菌的分離，以期找到最佳處理方式并對所得菌株進行活性篩選。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料為華中農業大學提供的華苧4號。試驗前兩個月，準備好相應的花盆，將華苧4號移植至武漢科技學院。

1.2 拮抗測定指示菌

大腸桿菌(Escherichia coli，EC);枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis，BS);熒光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescence，PF);紅發毛癬菌(Tricophyton rubrum，TR);白色念珠菌(Candida albicans，CA);黑曲霉(Aspergillus niger，AN);絮狀表皮癬菌(Epidermophyton floccosom，EF);島青霉(penicillium islandicum，PI);犬小孢子菌(microsporum canis，MC)。

1.3 樣品處理

春季(3月)將麻稈上的葉片剪下，剝下麻稈皮，洗凈葉片#65380;麻稈皮和麻稈芯，麻稈兩端削尖，剪成長1~1.5 cm小段，麻稈皮長寬均為1 cm。取新鮮葉#65380;老葉#65380;麻稈皮#65380;麻稈芯#65380;未經消毒的新鮮葉5種樣品，自來水洗凈后用75%酒精消毒1 min，再分別用1.25%和2.5%的NaClO消毒5#65380;10#65380;15和20 min，然后用75%酒精消毒1 min，最后用無菌水沖洗2~3次。每個處理樣品做20次重復。麻稈芯只作1.5%NaClO消毒15 min，其他步驟同新鮮葉。以未經消毒的新鮮葉為對照。夏季(5月)取新鮮葉#65380;老葉#65380;麻稈皮#65380;麻稈芯4種樣品，每個處理樣品5次重復，2.5%NaClO消毒15 min，其他消毒步驟同春季。

1.4 純化和保種

將材料接種于WA-抗生素培養基(瓊脂20 g，氨芐青霉素200 mg，鏈霉素200 mg，水1 000 mL)上，于28℃溫箱中培養3~7 d。取切口處新形成的菌絲，轉接至PCA培養基(馬鈴薯20 g，胡蘿卜20 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL)上，于28℃溫箱中培養3~7 d。如果同一處理的不同樣品上長出同種菌株，則合并在一起。最后將純化得到的菌株轉接至PCA斜面中，于4℃冰箱中保存。

1.5 菌株鑒定

菌株在PCA培養基上生長5 d后，挑取其菌絲體或孢子放在加有無菌水的載玻片上，制成水浸片于顯微鏡下觀察，結合菌株在培養基上的菌落形態進行初步鑒定。將孢子#65380;菌落形態相同的菌種歸為一類。

1.6 搖瓶發酵和浸膏提取

將菌株在PDA培養基(馬鈴薯20 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL)上活化，然后接種于400 mL查氏培養基(蔗糖30 g，NaNO3 2 g，KCl 0.5 g，MgSO4#8226;7H2O 0.50 g，FeSO4 0.01 g，K2HPO4 1 g，酵母膏1 g，水

1 000 mL)中。在28℃#65380;150 r#8226;min-1搖床上培養15 d后，濾去菌絲體，濾液用乙酸乙酯萃取，取上清，下層再萃取2~3次。用旋轉蒸發儀濃縮得浸膏。

1.7 活性檢測

將測試菌的細胞或孢子轉移至5 mL無菌水中，制成菌懸液后加入50℃左右的PDA或LB(酵母膏5 g，NaCl 10 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，pH=7.6)培養基中，混勻后再倒入底層為WA培養基的平板。或者用取液器吸取100 μL測試菌菌懸液，加入LB或PDA培養基中，并用涂布棒涂均勻。

在浸膏中加相應體積的丙酮將其稀釋到50 mg#8226;mL-1。吸取樣品溶液20 μL加在直徑為5 mm的圓形濾紙片上，待溶液干后平放于含有測試菌的平皿中，每個樣品4次重復，于28℃下培養2~4 d，觀察并測其抑菌圈大小。同時以100 μg#8226;mL-1青霉素(對細菌)和100 μg#8226;mL-1酮康唑(對真菌)為陽性對照，丙酮為陰性對照。

2 結果與分析

2.1 不同時間和濃度NaClO處理后各樣品主要內生真菌的種類和數量比較

從表1可以看出，苧麻內生真菌種類比較單一，大多為半知菌綱，主要為無孢菌群#65380;莖點菌屬#65380;炭疽菌屬#65380;鏈格孢屬#65380;小菌核屬和曲霉屬，它們均是常見的植物內生真菌[3]。其中，處理樣品中葉片和麻稈芯分離出來的內生真菌數量較少，而麻稈皮分離出來的內生真菌數量較多。

2.2 內生真菌生長速度比較

內生真菌長出的時間與NaClO處理的濃度和時間有密切關系，并且處理濃度的影響比處理時間的影響更為顯著。1.25%NaClO處理5 min新鮮葉#65380;麻稈皮和麻稈芯后2 d，內生真菌已基本長出;而2.5%NaClO處理20 min后12 d麻稈芯才長出內生真菌。麻稈皮中的內生真菌長出最快，處理后2 d就有63%長出，而麻稈芯和葉片中的內生真菌長出較慢。以上說明，NaClO處理濃度和處理時間的改變對分離的內生真菌的種類無影響，但對內生真菌生長速度有顯著影響。

2.3 春季和夏季樣品分離內生真菌的種類和數量比較

由表2可以看出，夏季樣品分離出來的內生真菌數量高于春季樣品，但是分離出來的種類沒有變化。在分離出內生真菌最多的麻稈皮中，MS#65380;PO#65380;CO#65380;AL占春季總數的比例分別為38.5%#65380;46.2%#65380;7.7%#65380;3.8%;占夏季總數的比例分別為41.0%#65380;33.3%#65380;17.9%#65380;5.1%。說明這4種菌是苧麻的“常駐”內生真菌，季節的變化對它們影響不大。

2.4 內生真菌體外抗菌活性初篩

由表3可知，苧麻內生真菌群的抗菌活性較強，其中兩株曲霉菌有廣泛的抗菌譜，菌株5對多數病源真菌和細菌都有抗性，特別是枯草芽孢桿菌;菌株7也表現出較強的抗菌活性。現已將菌株5進行固體發酵，以期分離出具有抗菌活性的化合物。

3 討論

內生真菌生活在植物組織內部，理應不受消毒濃度和時間的影響;而腐生真菌會隨著消毒試劑濃度的增大特別是處理時間的延長而除去。

在新鮮葉和老葉的內生真菌中，用1.25% NaClO處理后，菌株數量波動幅度較大，而用2.5% NaClO處理菌株數量波動幅度較小，所以宜選用2.5%的NaClO。

限于時間，本試驗只考察了苧麻內生真菌不同部位和兩個季節的分布，選取生境單一;而且苧麻葉#65380;麻稈芯的數據較少，較難判斷NaClO不同濃度及不同處理時間對其的影響。進一步的研究應另加不同生境下內生真菌的分布情況，并加大樣品量，以便得到更多數據，這樣就能從統計學的角度對時間#65380;空間進行判定。

本試驗所用浸膏濃度過高，為50 mg#8226;mL-1，浸膏宜稀釋后再用，以確保分析結果的合理性。由于本試驗只對真菌次生代謝產物進行了脂溶性成分的提取，而有效成分可能是水溶性物質，因此以后應采用多種篩選模型進行進一步的篩選。

本試驗為證明內生真菌的生物活性只對其作了拮抗人畜和植物致病菌測定，結論比較片面，應采用多種試驗模型進行同步篩選做到一菌多篩，提高命中率。

參考文獻:

[1] CARROLL G. Fungal endophytes in stemes and leaves: from latent pathoge to mutualistic symbiont[J]. Ecology，1988，69: 2-9.

[2] 任安芝，高玉葆.植物內生真菌——類應用前景廣闊的資源微生物[J]. 微生物學通報，2001，28(6):90-93.

[3] 鄒文欣，譚仁祥. 植物內生菌研究進展[J]. 植物學報，2001，43(9):881-892.