傷害對巴西橡膠樹膠乳中磷脂酶Ａ２的影響

摘要:以巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis Mull. Arg.)無性系PR107和熱研7-33-97為試驗對象，研究機械傷害#65380;外源茉莉酸及乙烯(利)等條件對膠乳C-乳清中磷脂酶A2的影響。結果表明，傷害和外源茉莉酸及乙烯(利)對磷脂酶A2均有誘導作用。其中機械傷害的誘導效應最為明顯，外源茉莉酸最適誘導濃度為0.08%，磷脂酶A2活性隨著外源乙烯刺激劑量的增加而增強。傷害信號能在傷害早期較明顯地誘導磷脂酶A2的活性。

關鍵詞:巴西橡膠樹;磷脂酶A2;傷害;茉莉酸;乙烯(利)

中圖分類號:S794.1;Q556+.4;S763.19 文獻標識碼:A 文章編號:0439-8114(2008)08-0923-04

磷脂酶A2(phospholipase A2，EC3.1.1.4，簡稱PLA2)在生物體內廣泛分布。按其來源可分為胞外分泌型PLA2(sPLA2)#65380;胞質Ca2+依賴型PLA2(cPLA2)和Ca2+不依賴型PLA2(iPLA2)3種類型[1，2]。植物體中PLA2催化細胞膜上磷脂的第2位酯酰鍵水解，生成溶血磷脂及游離的亞麻酸(linolenic acid)或亞油酸(linolic acid)。亞麻酸是茉莉酸(jasmonic acid，JA)和其他硬脂酸衍生物信號分子的前體，參與JA的生物合成。JA是植物防御反應中的重要調節子，可以激活多種植物防御反應相關基因的表達。PLA2參與了如脂代謝[3]#65380;炎癥反應#65380;活性氧的產生[4]#65380;離子通道功能[5]#65380;生長素刺激生長[6]#65380;植物-病原物相互作用和抗逆境[7]等細胞的許多生理過程。1998年，Yusof等人[8]從橡膠樹膠乳C-乳清中純化得到一種類patatin蛋白，并在離體條件下證明它是橡膠合成的抑制因子，它阻礙異戊二烯分子的延長。同年，Sowka等人[9]對膠乳過敏原Hev b7進行cDNA克隆，發現它與patatin同源。Kostyal等人[10]認為這種與patatin同源的膠乳過敏原是一種PLA2。本文研究了割膠(機械傷害)#65380;外源JA及乙烯(利)(化學傷害)對橡膠樹膠乳C-乳清中PLA2活性的影響，探討了PLA2作為磷脂信號傳導的重要組分，在植物防御反應中對割膠傷害#65380;外源JA及乙烯(利)刺激應答的關系，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

1.1.1 測定割膠傷害#65380;外源JA及乙烯利對橡膠樹幼樹膠乳中PLA2的影響 從本院試驗農場十一隊，選取1998年種植的25株無性系熱研7-33-97橡膠幼樹(試驗前這些樹從未受到割膠傷害)為試驗對象。分別進行5種處理，各處理均為5株樹，割制為S/2，d/3。一直不進行涂藥處理的作為對照;處理1——初割前用2 g含0.08%外源JA的羊毛脂處理;處理2——初割前用2 g 1.5%的乙烯利糊劑處理;處理3——初割刀不進行涂藥處理，初割后每個施藥周期第1刀割膠前用2 g含0.08%的外源茉莉酸的羊毛脂處理;處理4——初割刀不進行涂藥處理，初割后每個施藥周期第1刀割膠前用2 g 1.5%的乙烯利糊劑處理。初割后每次涂藥割3刀為一個施藥周期，使用混合采樣法取每個施藥周期的第2刀樣品。

1.1.2 測定不同濃度外源JA和不同劑量外源乙烯氣體分別對橡膠樹膠乳中PLA2的影響 以本院試驗農場沙田隊1990年種植的無性系PR107和熱研7-33-97橡膠樹為試驗材料，JA刺激濃度分別為0%#65380;0.04%#65380;0.08%#65380;0.12%，割制為S/2，d/3。乙烯氣體刺激劑量分別為0 mL#65380;10 mL#65380;30 mL#65380;80 mL，采用5cm短割線割膠，d/3。各處理均為5株樹，每次處理后割3刀為一個施藥周期，使用混合采樣法取每個施藥周期的第2刀樣品。

1.1.3 測定相同濃度外源JA和乙烯利分別對橡膠樹膠乳中PLA2變化的時間進程影響 以本院試驗農場沙田隊1991年種植的無性系熱研7-33-97橡膠樹為試驗材料，進行2 g含0.08%外源JA的羊毛脂及2 g 1.5%的乙烯利糊劑處理，刺激時間分別為0 h#65380;6 h#65380;12 h#65380;24 h#65380;36 h#65380;48 h，割制為S/2，d/3。每時段刺激3株樹，使用混合采樣法取樣。

1.2 測定方法

1.2.1 樣品的采集 割膠后待割面雜質流盡開始收集30 min內流出的膠乳，然后將膠乳置于冰凍試管中，迅速帶回實驗室備用。

1.2.2 PLA2的測定 ①粗酶液C-乳清的獲得，將所采集的新鮮膠乳置于4℃下，19 000 r#8226;min-1，離心1h。穿刺針法收集中層C-乳清為粗酶液，-20℃保存待用。②底物的配制，底物的配制采用Kawauchi[11，12]等的方法加以改進。稱取卵磷脂500 mg用少量乙醚溶解，加雙蒸水20 mL，65℃水浴約25 min，除去乙醚，再加上雙蒸水20 mL，冰浴攪拌乳化30 min，加0.05 mol#8226;L-1脫氧膽酸鈉2 mL，2.5 mol#8226;L-1 NaCl 4 mL，用0.02 mol#8226;L-1 KOH調pH至8.2，定容至100 mL，以此作為底物，現配現用。③測定酶活時取6 mL新鮮配制的底物，攪拌，加入粗酶液1 mL，同時計時，待反應1 min后，用0.02 mol#8226;L-1 KOH中和水解產生的脂肪酸，維持pH在8.2，根據KOH的消耗量求出酶活力?？瞻讓φ找? mL蒸餾水代替粗酶液。酶的一個活性單位定義為1 g蛋白1 min消耗KOH的毫升量。④蛋白質含量測定:采用Broford法[13](考馬斯亮藍G-250法)，并以牛血清白蛋白為標準。

2 結果與分析

2.1 測定割膠傷害#65380;外源JA及乙烯利對橡膠樹幼樹膠乳中PLA2的影響

由于投產的橡膠樹都在進行常年割膠生產，即常年傷害。為了研究割膠傷害#65380;外源JA及乙烯利對橡膠樹膠乳中PLA2的影響，選用未投產的橡膠幼樹為試驗材料測定膠乳中PLA2的活性。為了獲得膠乳必須進行割膠，而進行初割時被割膠樹還未來得及對割膠傷害做出防衛反應，所以認為此時采集到的膠乳為未受傷害影響的膠乳，圖1中初割刀表示第1次在幼樹上進行割膠傷害。初割刀中處理1和處理2比對照中PLA2活性顯著增加，分別為對照的3.12倍和2.81倍。由于處理3和處理4在初割刀時未涂藥，所以與對照差異不顯著。第1周期中，對照的PLA2活性比起初割刀時顯著增加了2.98倍。處理1和處理2酶活性也比初割刀有所增強，分別為初割刀時的1.2倍和1.15倍。處理3和處理4酶活性比初割刀顯著增強，分別為初割刀時的3.43倍和3.16倍。對照及4種處理隨著割膠次數的增加，酶活性逐漸增強。由此推知割膠傷害#65380;外源JA及乙烯利對PLA2均有誘導效應，其中割膠傷害的誘導效應最明顯。4種處理在第1周期中活性均高于初割刀，這可能分別是外源JA與割膠傷害#65380;外源乙烯利與割膠傷害共同作用，對膠乳PLA2活性誘導效率增強的結果。在周期性的連續傷害過程中，膠乳PLA2始終保持在一個較高的水平。

2.2 測定不同濃度外源JA和不同劑量外源乙烯氣體刺激對橡膠樹膠乳中PLA2的影響

由圖2可知，隨著外源JA刺激濃度的變化，膠乳中PLA2活性也相應變化。在橡膠樹無性系PR107和熱研7-33-97中，施用外源JA均比未施外源JA的處理的酶活性強，在0.08%的外源JA濃度刺激下，PLA2活性最強。根據上述結果進一步推斷外源JA可以誘導PLA2活性，JA對PLA2活性的最適誘導濃度為0.08%。

由圖3可知，隨著外源乙烯刺激劑量的增加，橡膠樹無性系PR107和熱研7-33-97膠乳中PLA2的活性也隨之升高。其中0 mL乙烯氣體刺激處理中PLA2活性最低，80 mL外源乙烯刺激處理中PLA2活性最高，10 mL和30 mL兩種外源乙烯刺激劑量間PLA2活性無明顯差異。根據上述結果進一步推斷，外源乙烯可誘導PLA2活性，酶活性隨著外源乙烯刺激劑量的增大而增加。

2.3 測定相同濃度外源JA和乙烯利刺激分別對橡膠樹膠乳中PLA2變化的時間進程影響

由圖4可知，在外源JA處理情況下割膠12 h時PLA2活性出現一個峰值，0 h處理的PLA2活性為1.89倍，隨后在24 h#65380;36 h#65380;48 h時酶活性均有所降低。外源乙烯利處理情況下，割膠6 h時PLA2活性出現一個峰值，0 h處理的PLA2活性為1.59倍，當在12 h時酶活性有所下降，隨后24 h#65380;36 h#65380;48 h時PLA2活性變化均趨于平緩。傷害信號只能在傷害早期較明顯地誘導PLA2活性，隨著割膠時間的延長，PLA2活性基本恢復到傷害前的水平，這可能是傷害信號被植物感知并傳遞到靶位點需經過一定的時間所造成的。

3 討論

Narváez-Vásquez[14]等利用傷害#65380;系統素#65380;寡糖素處理番茄幼苗，能誘導PLA2活性增加。利用PLA2抑制劑研究PLA2活性與蛋白酶抑制劑(protein inhibitor，PI)含量變化的相關性，發現PLA2活性參與了傷害#65380;系統素#65380;寡糖素引起的信號傳導的早期事件，并導致防御蛋白的合成及積累[15]。與上述結果相一致，本研究中在割膠傷害早期，未傷害(未開割)幼樹初割后，PLA2活性顯著增加，隨后割次中，PLA2活性均高于未傷害的幼樹。傷害信號能誘導PLA2活性，膠乳PLA2可能在傷害反應中參與胞內信號級聯反應，為調節膠乳防御基因的表達提供了間接證據。

根據曾日中等[16]的結果顯示，外源JA可顯著促進涂藥部位膠乳脂氧合酶的活性，以膜上磷脂脂解后產生的亞麻酸為底物的脂氧合酶是內源JA合成途徑上的關鍵酶，本試驗研究結果表明，施用外源JA處理的膠乳PLA2活性高于未施外源JA的處理，外源JA同樣可以促進涂藥部位膠乳PLA2活性。已有證據表明，外源JA和傷害可以誘導內源JA的合成，從本試驗所得結果推測，外源JA可能是通過誘導膠乳PLA2活性后釋放內源JA合成的前體亞麻酸，以供脂氧合酶進一步催化產生內源JA。

由于膜上磷脂代謝途徑的復雜性及細胞內信號途徑的多樣性，今后除了對PLA2進行研究外，對已克隆和鑒定的其他磷脂酶需做橫向比較，而對磷脂信號系統和傷害信號系統相互或交叉影響(cross talking)的研究，有利于進一步闡明細胞內信號傳導的機理。利用PLA2抑制劑研究膠乳PLA2與蛋白酶抑制劑基因(pin基因)表達的相關性，檢測防御蛋白的合成與積累，可以為傷害反應中PLA2參與胞內信號級聯反應并調節橡膠樹防御基因的表達提供直接證據。

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