蒜氨酸酶的分離純化條件分析

摘要:采用(NH4)2SO4鹽析#65380;Sephadex G-200凝膠過濾對蒜氨酸酶進行了部分純化。結(jié)果表明，蒜氨酸酶的含量和酶活性在(NH4)2SO4為30%~50%時較高，40%時蒜氨酸酶活性最高;經(jīng)Sephadex G-200凝膠過濾獲得的酶液純化倍數(shù)為34.45，回收率為1.72%。

關(guān)鍵詞:蒜氨酸酶;大蒜;分離;純化

中圖分類號:Q503 文獻標識碼:A 文章編號:0439-8114(2008)08-0945-02

大蒜(Allium sativum)為百合科蔥屬#65380;多年生草本植物。大蒜所具有的獨特風(fēng)味及藥用價值主要是由于大蒜能產(chǎn)生一種叫做蒜素(allicin)的物質(zhì)。當(dāng)大蒜受外力作用，如碰傷或切片#65380;搗碎后，原來與蒜氨酸存在于不同部位的蒜氨酸酶得以與之接觸，該酶被溶解的微量氧所激活，這樣蒜氨酸在蒜氨酸酶的催化作用下，發(fā)生酶促生物化學(xué)反應(yīng)，水解生成有刺鼻氣味的大蒜素[1]。蒜氨酸酶(alliinase)又稱蒜酶#65380;烷基半胱氨酸亞砜酶。在完整的細胞內(nèi)，蒜氨酸酶和底物是分隔存在的，蒜氨酸及其亞砜類化合物存在于細胞溶膠中，而蒜氨酸酶存在于液泡中。當(dāng)細胞受傷時，蒜氨酸酶就會和蒜氨酸相遇發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生丙酮酸#65380;氨以及包括蒜素在內(nèi)的含硫化合物[2]。1949年Stoll和Seeback首次從大蒜中分離得到蒜氨酸酶，其后很多人通過用大蒜勻漿離心#65380;硫酸銨分級沉淀#65380;透析#65380;葡聚糖凝膠柱層析等方法分離純化蒜氨酸酶，并對其性質(zhì)進行了多方面的研

究[3-7]。目前研究表明，蒜氨酸酶含量不高，對環(huán)境較為敏感，活性不穩(wěn)定，加之目前的生產(chǎn)條件常會導(dǎo)致該酶活性的破壞，使得蒜類產(chǎn)品的藥理作用不顯著[5]。本試驗對蒜氨酸酶的純化條件進行摸索，得到了活性較高且相對穩(wěn)定的酶，為其理化性質(zhì)的進一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

天津紅皮新鮮大蒜。

1.2 方法

1.2.1 酶活性的測定 用丙酮酸法測定酶活性[8]，精確吸取1 mL酶液和1 mL底物于試管中，搖勻，25℃保溫5 min，加入2 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)2 min，再加1 mL 2，4-二硝基苯肼反應(yīng)5 min后，然后加1.0 mol#8226;L-1 NaOH溶液5 mL，反應(yīng)10 min后于420 nm比色。以在25℃條件下，每產(chǎn)生1 μmol丙酮酸為1個活力單位(U)。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量的測定 紫外吸收法[9]測定蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 Sephadex G-200凝膠層析 將脫鹽透析#65380;脫水濃縮的樣品經(jīng)Sephadex G-200凝膠過濾#65380;洗脫，每管收集5 mL，收集50管，測定收集洗脫液的蛋白質(zhì)含量及蒜氨酸酶的酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同(NH4)2SO4對蒜氨酸酶的分離純化

蒜氨酸酶上清液用硫酸銨溶液沉淀，硫酸銨飽和度分別達到10%#65380;15%#65380;20%#65380;25%#65380;30%#65380;35%#65380;40%#65380;45%#65380;50%#65380;55%#65380;60%#65380;65%#65380;70%和75%，放置于4℃靜置2~3 h，低溫8 000 r#8226;min-1離心30 min后取上清液，待測酶活和蛋白質(zhì)含量。結(jié)果見圖1，蒜氨酸酶的含量和酶活性在(NH4)2SO4為30%~50%時較高，40%時蒜氨酸酶活性最高，硫酸銨濃度在30%~50%之間沉淀得到的蒜氨酸酶作為初步純化酶液。

2.2 Sephadex G-200凝膠過濾層析純化結(jié)果

由圖2可以直觀地看到，分離結(jié)果得到多個蛋白質(zhì)峰值和酶活峰值。1~8管#65380;33~50管蒜氨酸酶活性較低，說明僅有較少量的雜蛋白;13~25管酶含量和蛋白含量相關(guān)性較強，酶活高的酶液蛋白質(zhì)含量也相應(yīng)增加，說明該酶主要在這一段區(qū)間被洗脫純化出來，所含雜蛋白較少;26~32管蛋白含量和酶活明顯下降，說明此時該酶含量正逐步減少，主要是小分子量的雜蛋白被洗脫出來。因此，13~25管酶液作為純化結(jié)果。

2.3 蒜氨酸酶純化步驟結(jié)果比較

將不同處理方式得到的酶液進行純化比較，結(jié)果見表1。由表1可知，最后獲得的酶液純化倍數(shù)為34.45，與文獻相比純化程度差距較大，有關(guān)研究的純化結(jié)果有多種，最低為14倍[6]，最高為200倍[5]，而本試驗比最低純化結(jié)果高，但與更高的純化結(jié)果仍有較大距離，原因很可能是酶活測定中本試驗采用天然底物。在硫酸銨分級沉淀中，本試驗以30%~50%之間的飽和溶液進行初步純化，這也與現(xiàn)有文獻[5，6]略有不同。由于生物具有多樣性和地域性，細胞成分及含量不盡相同;以及蒜氨酸酶對環(huán)境因素很敏感，活性容易受到抑制，在試驗過程中最好加入穩(wěn)定劑，如甘油#65380;NaCl等。本試驗是以天津紅皮新蒜為研究材料，不同于其他文獻中使用的新疆鮮蒜[6，7]或蒜粉[5]，因此本次純化結(jié)果對于該種鮮蒜的性質(zhì)研究具有重要意義。

3 討論

由于甘油#65380;NaCl等能夠穩(wěn)定蒜氨酸酶的構(gòu)象，在此基礎(chǔ)上加入具有激活劑性質(zhì)的金屬離子如Ca2+#65380;Mg2+#65380;Zn2+#65380;Fe2+等能夠有效提高該酶活性，從而在純化過程中更直接有效的跟蹤酶的純度和位置;在蒜氨酸酶的酶解反應(yīng)中，磷酸吡哆醛作為輔酶能更好的促進反應(yīng)進行，使得對于產(chǎn)物的監(jiān)測更加快速準確。因此純化過程中使用的緩沖液#65380;透析液和洗脫液中應(yīng)適當(dāng)加入穩(wěn)定劑#65380;激活劑或輔酶。

在酶活反應(yīng)中，最終產(chǎn)物呈現(xiàn)紅棕色，該物質(zhì)顏色不穩(wěn)定，容易衰減，會影響吸光度值，進而導(dǎo)致酶活和比活力的偏差，不能客觀的反映純化效果。經(jīng)過多次試驗，發(fā)現(xiàn)在酶活反應(yīng)結(jié)束后30 min內(nèi)其顏色基本保持穩(wěn)定，因此建議在這段時間內(nèi)完成吸光度值的測定。

在硫酸銨分級沉淀和透析脫鹽中，蒜氨酸酶的損失較為嚴重，主要是由于鹽析作用去除了大部分的蛋白質(zhì)包括該酶，以及透析袋較強的吸附性導(dǎo)致了酶含量的損失。因此純化的蒜氨酸酶回收率較低，僅有1.72%。

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