胃內幽門螺桿菌在口腔中的分布特點

摘 要: 目的：通過多聚酶鏈反應(PCR)檢測胃病患者口腔中的幽門螺桿菌(HP)。方法：從13例有上消化道癥狀、經內鏡檢查證實的胃病患者采集胃黏膜、口腔含漱液和6個牙位的齦上及齦下菌斑，應用(PCR)檢測標本中的HP。同時用酶聯免疫法檢測靜脈血、唾液、齦溝液中抗HP特異性IgG抗體。結果PCR檢測胃黏膜均為HP陽性。6例患者(46.2％)的含漱液和11例患者(84.6％)的至少一份菌斑樣本中檢測出HP。口腔黏膜與胃黏膜HP陽性率高于一般人，此外從患者靜脈血、唾液、齦溝液中均可檢測到HP特異性IgG抗體。結論：本研究結果表明齦溝或牙周袋可能是口腔HP聚集的適宜環境。

關鍵詞: 幽門螺桿菌 牙菌斑 齦溝液 特異抗體

資料方法

一般資料：13例主訴有上消化道癥狀而進行內鏡檢查的患者，男8例，女5例，平均42歲(34~52歲)，無其他重要系統性疾病，3個月內未服抗生素及胃病，均有牙齦炎或輕度牙周炎，過去12個月內未接受牙周治療，全口牙不少于24顆。

取樣和檢查：①口腔取樣：所有受檢者檢測晨均按指導刷牙，取樣前用無菌生理鹽水輕輕將口腔漱干凈，上午收集無刺激唾液1份，從每個患者口腔中的6個區段各選擇有牙齦炎癥的1顆牙作為取樣牙，隔濕吹干后，用消毒刮匙取齦上菌斑留存。用what man 3 mm濾紙條收集(袋內法)30秒齦溝液。刮取齦下菌斑。口腔含0.9％生理鹽水10ml鼓漱1 5秒后留存于離心管。取樣后檢查并記錄牙周臨床指數、菌斑指數、探診深度(PD)、出血指數(BI)。 ②胃內取樣：口腔取樣后立既進行常規胃鏡檢查，在胃竇部共取4塊組織，1塊做HP尿素酶試驗；2塊用10%福爾馬林固定，石蠟切片，用Worthin-Starry銀染色辨認HP，并做出組織病理學診斷；另一塊用于PCR擴增檢測HP。

口腔及胃內取樣后抽取前臂靜脈血2ml，提取血液與唾液、齦溝液等標本置-70℃保存。

PCR檢測HP：①DNA提取：口腔含漱液經離心(12000轉/分，5分鐘)后棄上清，沉淀物及菌斑樣本均在2小時內按PCR試劑盒說明書用快提法提取DNA。胃組織DNA提取流程如下：置0.5ml Tris-EDTA緩沖液(PH8.0)研磨勻漿，加10％十二烷基硫酸鈉(SDS)至濃度為1％，蛋白酶K(20mg／ml)至終濃度為100mg/ml，5.5℃水浴1小時，用等體積酶-氯仿-異戊醇(25：24：1)抽取2次，純酒精沉淀，1200轉/分(4℃)離心10分鐘，沉淀用超凈水溶解，-20℃備用。②PCR檢測：PCR試劑盒內含2對引物，分別根據HP尿素酶C基因和細胞毒素相關基因設計，目的片段為294bp和400bp。PCR擴增采用20μl反應體系，2對引物各20pm，口腔標本4μl(胃黏膜標本2μl)作為DNA模板。反應混合液在94℃預變性5分鐘，并以94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃2分鐘為一循環，共計35個循環，最后一個循環72℃繼續延伸7分鐘。采用HP標準株NCTC11637和1株HP臨床分離株DNA分別作為陽性模板，PCR試劑盒提供陰性對照。擴增產物以8%丙稀酰胺電脈簽定。為避免交叉傳染，分別在3個房間進行DNA提取PCR擴增和產物的電泳分析。③ELISA檢測抗HP IgG抗體，用金菌抗原(由中國人胃中分離的HP臨床株制作)包被酶標板。血清標本PBSTTGG(0.01mg/ml硫柳汞，0.05%吐溫-20，1.0mg/ml明膠，50mg/mlγ-球蛋白)1：800稀釋，齦溝液以50μl IPBSTTGG 2次離心洗提(1000轉/分，4℃)，上清用于抗體檢測。取稀釋后的血清、洗提后的齦溝液、未經稀釋的唾液個100μl分別加入孔。已知HP抗體陽性的血清和陰性血清作為對照。在酶標讀數儀(BIO-PCR450)415nrm波長下讀數，判斷值≥1.0為陽性。

結 果

胃黏膜標本檢測結果：13例胃黏膜標本中有12例銀染法與PCR法均為HP陽性，另1例銀染法陰性，而PCR陽性。

口腔中的HP檢測：PCR結果顯示13例患者中有6例(46.2%)從含漱液中檢出HP，11例(84.6%)患者至少有1份菌斑樣本中檢出HP。齦下菌斑中HP的檢出率(30/78，38.5%)顯著高于齦上菌斑(15/28，19.2%)(P<0.01)。齦上和齦下菌斑共156份合并計算，其中尿素酶C基因陽性率為28.8%(45/156)，尿素酶C基因和cag A基因共同陽性為3.2%(5/156)，這些雙陽性的標本來自2例患者的3顆牙齒(齦上3份，齦下2份)。

抗HP特異抗體檢測：從血清、唾液、齦溝液中均可檢測到抗HP IgG抗體。檢出率依次為血清、唾液、齦溝液。

討 論

與其他常規方法相比，PCR技術顯著提高了口腔HP的檢出率，我們選擇美國市售PCR試劑盒，2對引物根據尿素酶C基因和cagA基因設計，Bickiey、Lage等通過雜交和酶切證實了其特異性，其敏感性可達到檢出100個細菌。本研究結果也證明PCR比常規的Warthin-Starry銀染法敏感。針對以往口腔HP研究，無論采用常規方法還是PCR，結果往往不一致。Mapstone、Nguyen等從有限的病例中采集多份口腔標本(菌斑、唾液)，陽性率分別達到38.5%和27.8%，顯示口腔的HP的檢出率存在不規律性。而國內報道用PCR檢測胃炎患者唾液中HP，檢出率較低(5.71％，6/105)。我們分析，以往研究存在差異的重要原因之一在于菌斑或唾液中HP的數量較少，而且在口腔內的分布規律不清楚，加之許多研究僅取一份菌斑或唾液，導致假陰性率較高；而口腔HP分布規律的研究也尚未得到重視。本研究從每位患者口腔中取多份樣本檢測，可提高檢出率。從研究結果看，齦下菌斑HP檢出率(38.5%)顯著高于齦上菌斑(19.2%)，其中2例患者齦下菌斑中檢出HP，而其他所有齦上菌斑及含漱液均未檢出，提示齦溝或牙周袋可能是口腔HP聚集的適宜環境。進一步研究應擴大樣本量，以期更為準確地反映口腔內HP的存在情況和分布特點。