應用熒光偏振與ＥＬＩＳＡ方法檢測ＨＢＶ ＤＮＡ結果分析

摘 要: 目的：建立一種簡便、靈敏、特異的DNA檢測方法。方法：用熒光偏振技術檢測102例乙型肝炎患者血清中的HBV DNA，并與多聚酶鏈反應一酶聯免疫吸附試驗(PCR-ELISA)方法作比較。結果：該方法可以檢測出1×101拷貝的HBV DNA模板，CV 為6.44%，對102例乙型肝炎患者的血清進行檢測，HBsAg(+)、HBeAg(+)、抗HBc(+)血清HBV DNA 陽性率為100%；HBsAg(+)、抗HBe(+)、抗HBc(+)血清HBV DNA陽性率為81.8%；HBsAg(+)、抗HBc(+)血清HBV DNA陽性率為72.4%，其余為陰性。30例非乙型肝炎患者血清中HBV DNA的檢測結果均為陰性。結論：該方法簡單、靈敏、特異，適用于臨床進行大樣本核酸檢測。

關鍵詞: 乙型肝炎病毒 脫氧核糖核酸 多聚酶鏈反應 熒光偏振 檢測

資料與方法

主要儀器和試劑：MJ Research V2.0；Victor Ⅱ熒光偏振檢測儀；dNTPs、Taq DNA聚合酶。引物和探針：PCR引物源于HBV DNA C區：Ncbi Genbank：(AY123041.1 GI：22415734)。C1(1901-1920)：5'-TGGAGCTTCTGTGGAGTTAC-3'；C2(2160-2141)：5'-GGAGTGCGAATCCACACTCC-3'；探針(1846-1832)：5'-AAAGAAGTCAGAAGG-R110-3'。血清標本：102例已確診的乙型肝炎患者血清，30例已確診非乙型肝炎患者血清。

血清處理：煮沸法，具體操作步驟見文獻［1］。

PCR擴增反應和液相雜交［2］：取2μl模板加到28μ1 PCR反應液中(10×PCR緩沖液3μ1，dNTPs各160μmol/L，上游通用引物C1和下游通用引物C2各3pmol，探針1.5pmol，Taq DNA聚合酶1U)。PCR程序：94℃ 2分鐘后進入循環，94℃ 5秒，60℃ 55秒，72℃ 45秒，循環25次，最后94℃ 5秒，45℃ 20秒。

探針雜交［3］：取10μ1雜交后的PCR產物加入含有45μ1雜交液［其中含1g／L聚乙二醇4000，300ml/L DMSO，6×SSC(pH 10)，0.01mol/L磷酸鈉(pH 8.0)，1mmol/I.EDTA(pH 8.0)，5g/L SDS，100fg/ml變性鮭魚精DNA，5g/L脫脂奶粉］的用于熒光偏振檢測的微孔中，混勻后40℃水浴放置10分鐘，然后用VictorⅡ熒光偏振檢測儀檢測熒光素R110的偏振值。 

判定標準：隨機選10份HBV DNA陰性血清和10份HBV DNA陽性血清進行檢測，cut off值=陰性樣本結果的平均偏振光值+10%×陽性樣本結果的平均偏振光值。偏振光值>cut off值×110%的樣本為陽性，

結 果

PCR反應體系中探針濃度的確定：PCR反應液中探針濃度分別為50、5、0.5和0.05 μmol/L。分別對模板數為5×101拷貝的陽性對照和陰性對照進行PCR擴增和雜交，結果探針濃度為0.5～5μmol/L時均能檢測陰陽性對照。當探針濃度偏低(0.05μmol/L)和偏高(50μmol/L)時，檢測結果出現假陰性和假陽性，因此最終探針濃度確定為0.5μmol/L。

PCR-FP的最低檢出量：對HBV DNA拷貝數分別為1×101、1×102、1×103和1×104拷貝及陰性對照進行檢測，結果該方法可以檢測到1×101 拷貝的模板。偏振光值分別為72、95、132、184和44mp(陰性)。

重復性實驗：用PCR-FP對一個HBV DNA陽性樣本重復檢測10次，偏振光值分別為115、110、97、117、96、105、98、109、108和113mp，CV=6.44%。

PCR-FP與PCR-ELISA比較：用2種方法對102例乙型肝炎患者的血清進行檢測，PCR-FP檢測方法對HBsAg(+)、HBeAg(+)、抗HBc(+)的血清檢出率為100%(40/40)；HBsAg(+)、抗HBe(+)、抗HBc(+)的血清檢出率為81.8%(27/33)；HBsAg(+)、抗HBc(+)血清檢出率為72.4%(21/29)。而30例非乙型肝炎患者的血清PCR-FP檢驗結果均為陰性。

討 論

PCR-ELISA分3個主要步驟，第1個步驟是PCR擴增，第2個是PCR產物和探針的雜交過程，第3個是ELISA檢測。而PCR-FP方法將上述第1和第2步合二為一，因此PCR擴增和探針液相雜交在同一管中進行，即將探針直接加到PCR反應液中，隨PCR反應一同完成。由于探針的3'端為ddUTP-R110，使得探針不能被延伸；另外探針的退火溫度為40℃，而PCR引物的退火溫度為60℃。因此，在PCR過程中，熒光標記探針無法與模板結合，不會影響PCR反應。PCR反應結束，熒光標記探針則與PCR產物上相應區域結合，形成雜交雙鏈。在反應體系中加入雜交液可使產物雙鏈DNA的退火溫度降低至40℃下，可使非特異的雜交探針解離，提高了探針與產物雜交的特異性。由于熒光素和雙鏈DNA相連，相對分子質量明顯增大，從而使熒光偏振增大，而游離探針上熒光素的熒光偏振光不增加，由此儀器可以將特異雜交雙鏈檢測出來。

我們的方法目前需要解決的問題：PCR擴增用的微孔板與熒光偏振光檢測用的微孔板尚不能通用，PCR擴增產物必須手工轉移到熒光偏振光檢測用微孔板中，因此操作仍存在麻煩之處，也存在污染的可能，需要采取防污染的措施。但是，我們的方法與PCR-ELISA相比，實現了擴增與雜交一體化，簡化了操作步驟，縮短了整個實驗的時間。 

參考文獻

1 Guo YH，Yan J，Meng XR，et al.A quantitive PCR kit used in automatic genetic amplification instrument.J Fourth Mil Med Univ，2001，22:1349-1351.

2 Dieffenbach CW，Dveksler GS.PCR primer a laboratory manual.USA:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995:143-153.