１３個(gè)葡萄品種白藜蘆醇含量的研究

摘要：以13個(gè)葡萄品種為試材。采用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)其不同發(fā)育時(shí)期的葉片，果皮中白藜蘆醇的含量。結(jié)果表明：不同葡萄品種中白藜蘆醇含量不同；同一品種葡萄的各器官中白藜蘆醇含量也不同，一般而言成熟果皮>成熟葉>莖段；不同成熟期葉片中白藜蘆醇含量依次為成熟葉>老葉>嫩葉，不同成熟期果皮中白藜蘆醇分布的規(guī)律為成熟果皮>嫩果皮；在所有檢測(cè)樣品中以刺葡萄的成熟果皮中白藜蘆醇含量最高，為12.903μg／g。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜、葡萄、白藜蘆醇

白藜蘆醇(resveratrol，3，5，4-基苯代乙烯-反-均二苯代乙烯)是含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物，存在于許多植物中，其中葡萄、虎仗等植物的含量較高，它是植物體在惡劣環(huán)境下或遇到病原侵害時(shí)自身分泌的一種抗毒素，因此有“植物殺菌素”之稱。現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明，白藜蘆醇能夠阻止低密度脂蛋白的氧化。具有抗菌、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、防治心臟病、抗癌、抗血小板凝集與血管松弛、降低血脂和抗誘變等多種藥理作用，并被確認(rèn)為抗腫瘤劑和治療心血管疾病的有效成分，因此被喻為繼紫杉醇之后的又一新的綠色抗癌藥物。近年來(lái)，歐美各國(guó)已將其開發(fā)成保健食品上市，劑型有片劑、膠囊、口服液等。目前白藜蘆醇主要從葡萄皮、虎杖等植物中提取得到，因此篩選出高含量的葡萄資源具有重要意義。

1、材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 試材取自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)三年生葡萄園共13個(gè)品種。歐亞種：紅地球、紅寶石無(wú)核、優(yōu)無(wú)核、維多利亞，粉紅亞都蜜、奇妙無(wú)核，秋紅、美人指。歐美種：巨峰、夏黑無(wú)核、夕陽(yáng)紅。東亞種：刺葡萄、腺枝葡萄。

1.2儀器和試劑 島津LC-10A高效液相色譜儀，分析天平，超聲波清洗器，甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，超純水，白藜蘆醇對(duì)照品(99％)，其余試劑均為分析純。

1.3測(cè)定方法 采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)葡萄器官中白藜蘆醇的含量進(jìn)行檢測(cè)，所有的提取操作及測(cè)定工作均在嚴(yán)格避光的條件下進(jìn)行，以避免白藜蘆醇的氧化和分解。

1.3.1樣品溶液的制備取13個(gè)葡萄品種新鮮無(wú)病害葉片(幼葉、成熟葉，老葉)，莖段各10g，乙酸乙酯勻漿磨碎，再用乙酸乙酯提取液定容到100ml，45℃超聲波處理30min，避光常溫下浸提24h，砂芯漏斗過(guò)濾。將濾液在45℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，用甲醇定容到10ml，定容后用經(jīng)過(guò)0.45um濾紙過(guò)濾，待HPLC檢測(cè)。

取新鮮無(wú)病害成熟葡萄果實(shí)和坐果后1個(gè)月的嫩果果實(shí)，去掉果肉剝?nèi)」ぃ?g新鮮果皮放入真空干燥箱內(nèi)干燥至恒重(45℃)。將干燥葡萄皮磨碎加入乙酸乙酯提取液定容到100ml，45℃超聲波處理30min，避光常溫下浸提24h，然后用砂芯漏斗抽濾。將濾液在45℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，再用甲醇定容到10ml，定容后經(jīng)過(guò)0.45um濾紙過(guò)濾，待HPLC檢測(cè)。

1.3.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取白藜蘆醇對(duì)照品15mg，置于50ml容量瓶中，用甲醇溶解定溶至刻度，混勻制成300ug／ml標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，備用。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備1.0ml稀釋成3.0ug／ml標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液，備用。

1.3.3色譜分離條件色譜柱Shim-packVP-ODS C18 5um 4.6×150mm；流動(dòng)相為乙艄：水=30：70；流速1.0mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)302nin柱溫40℃；進(jìn)樣量10uL。含量計(jì)算方法采用外標(biāo)一點(diǎn)法進(jìn)行計(jì)算。

1.3.4樣品中白藜蘆醇含量的測(cè)定。將制備好的供試液，各進(jìn)樣10μl，記錄峰面積并計(jì)算白藜蘆醇的含量。

2、結(jié)果與分析

2.1不同葡萄品種中葉片、莖段和果皮中白藜蘆醇的含量 不同葡萄品種中自藜蘆醇含量不同，同一種葡萄的各器官中白藜蘆醇含量也不同。因此不同種類葡萄中白藜蘆醇含量高低沒(méi)有明顯的規(guī)律。其中，在成熟葉中白藜蘆醇含量最高的為粉紅亞都蜜，達(dá)4.316 μg／g，最低的為紅寶石，為0.217 μg／g。在莖段中白藜蘆醇含量最高的為紅寶石，達(dá)0.548 μg／g，最低的為秋紅，為O.056 μg／g。在果皮中自藜蘆醇含量最高為刺葡萄，達(dá)12.903 μg／g，最低的為優(yōu)無(wú)核，達(dá)1.537 μg／g。

從表1數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了白藜蘆醇在同一葡萄品種各器官中含量分布的規(guī)律，即成熟果皮>成熟葉>莖段。

2.2不同成熟期葉片、果皮中白藜蘆醇的含量 不同種類不同葡萄品種中不同成熟期葉片和不同成熟期果皮中自藜蘆醇含量不同。

發(fā)現(xiàn)同一葡萄品種中不同成熟期葉片和不同成熟期果皮中自藜蘆醇分布的規(guī)律：成熟葉>老葉>嫩葉，如粉紅亞都蜜的成熟葉中自藜蘆醇含量為4.316 μg／g是嫩葉的3.5倍；成熟果皮>嫩果皮，如刺葡萄的成熟果皮中白藜蘆醇含量為12.903 μg／g是其嫩果皮的12倍。

3，討論

作為葡萄屬植物體內(nèi)的一種抗毒素，白藜蘆醇的生物合成不僅受到病原侵害、不良外界環(huán)境條件等因素的影響，也與種類品種的差異有關(guān)。有研究表明，在相同的自然條件下，不同品種的葡萄其合成白藜蘆醇的能力差異較大。陳雷的研究表明：瑰寶、峰壽，牛奶，花澤巨峰等鮮食葡萄的白藜蘆醇含量較低，而赤霞珠，希拉、米勒、白詩(shī)南，梅露汁等釀酒葡萄的白藜蘆醇含量則較高。向陽(yáng)等對(duì)新疆不同地區(qū)19個(gè)品種葡萄皮中自藜蘆醇進(jìn)行了研究比較，發(fā)現(xiàn)伊寧產(chǎn)紅克里米斯克的含量最高為155.20 μg／g，其次為該區(qū)產(chǎn)的紅地球，含量為41.70μg／g，其余品種含量均在1-17μg／g，而侯斌峰發(fā)現(xiàn)鄯善馬奶子葡萄葉中白藜盧醇的含量592.83μg／g，高于伊寧產(chǎn)紅克里米斯克葡萄皮中的含量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同種類葡萄中白藜蘆醇含量有較大的差異，白藜蘆醇含量最高為刺葡萄果皮，為12.903μg／g，最低為維多利亞莖段0.014 μg／g。但各品種間含量的高低并沒(méi)有明顯的規(guī)律。

葡萄不同組織中白藜蘆醇的含量不同。陳雷的研究發(fā)現(xiàn)了不同部位白藜蘆醇的含量變化的大致趨勢(shì)：果穗軸，果皮>葉片、種籽，葉柄>果肉。而段朝輝通過(guò)研究中國(guó)葡萄野生種11個(gè)種或變種36個(gè)株系成熟漿果中白藜蘆醇的含量，認(rèn)為白藜蘆醇在果穗的不同組織中含量最高的組織是穗軸，其后依次是果皮，種籽和果肉。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了白藜蘆醇在同一葡萄品種各器官中含量分布的規(guī)律，即成熟果皮>成熟葉>莖段。

在葡萄的不同生育時(shí)期，其白藜蘆醇的含量也會(huì)發(fā)生較大的變化。段朝輝發(fā)現(xiàn)毛葡萄丹-2和歐洲葡萄黑諾比漿果，其白藜蘆醇含量最高時(shí)期為生理成熟期，依次是轉(zhuǎn)熟期和綠果期；余興等的研究表明，在蛇龍珠葡萄生K期間，其果實(shí)白藜蘆醇含量在8月10日達(dá)到最高。本實(shí)驗(yàn)中，白藜蘆醇的含量變化規(guī)律是成熟葉>老葉>嫩葉，成熟果皮>嫩果皮。

在所有檢測(cè)器官中，刺葡萄的成熟果皮中白藜蘆醇含量最高，為12.903μg／g。因此，在成熟期采收果實(shí)可有效獲得和利用白藜蘆醇。當(dāng)前刺葡萄主要用于釀制葡萄酒，其葡萄皮是原料中的主要廢棄物，因此可以從這些廢棄物中提取白藜蘆醇，這為刺葡萄的開發(fā)和利用提供了一條高附加值的綜合利用途徑。