血管內皮生長因子１６５基因轉染的骨髓基質細胞異位成骨的初步研究

高全文　柳春明　宋慧鋒　柴家科

[摘要]目的：將血管內皮生長因子165（VEGF165）基因轉染的大鼠骨髓基質細胞（MSCs）和β-磷酸三鈣復合后，植入原大鼠肌肉中，探索轉染外源基因的MSCs異位成骨能力。方法：SD大鼠12只，在全麻及無菌條件下取其左側股骨的骨髓基質細胞，并用礦化液誘導培養。在脂質體介導下將構建成功的真核表達載體pcDNA3.1- VEGF165轉染到誘導培養的MSCs，G-418篩選陽性細胞克隆，將陽性克隆細胞和未轉染的MSCs共同接種于β-磷酸三鈣上，體外培養7天后，植入原大鼠肌肉內。分別于4周、8周和12周處死動物，觀察異位成骨情況。結果：骨髓基質細胞－β-磷酸三鈣復合體植入肌肉后，材料周圍血管生長較多，隨著植入時間的延長，小的骨島逐漸融合為大的骨塊，并有骨髓腔樣結構，表現出較好的異位成骨能力。結論：應用VEGF165基因轉染MSCs作為種子細胞植入體內后，有利于發揮VEGF165的血管化作用，同時促進組織工程骨的成骨速度，將會成為組織工程骨血管化探索的方向。

[關鍵詞]血管內皮生長因子165；骨髓基質細胞；β-磷酸三鈣

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2009）01-0069-03

A primary study on the osteogenic characteristic of MSCs with VEGF165 gene

GAO Quan-wen1,LIU Chun-ming,SONG Hui-feng,CHAI Jia-ke

（1.Department of Burn and Plastic Surgery，the First Hospital Affiliated to PLA General Hospital, Beijing 100037，China; 2.Department of Plastic Surgery, PLA General Hospital，Beijing 100853，China）

Abstract： ObjectiveTo investigate the osteogenic characteristic in vivo of rat bone marrow stroma cells (MSCs) with Vascular endothelial growth factor 165 gene (VEGF165) combined onto β-tricalcium phosphate（β-TCP）.MethodsMSCs were obtained from femurs of 12 SD rats under general anesthesia and sterile condition, and cultured in DMEM supplemented with 10%FBS. MSCs were cultured in a conditional medium in subculture including: dexamethasone, vitamin C, and β-glycerophosphate. At the same time, we constructed the eukaryotic expression vector containing VEGF165gene. VEGF165 gene was transfected into MSCs by means of LipofectAMINE?2000. The stably gene expressive cells were screened with G-418 for 14 days. The cell mixture were combined onto β-TCP and cultured in vitro for 7 days. The cells-ceramic compound was implanted intramuscularly into the corresponding rat. These rats were executed after 4w, 8w, 12w.The osteogenic characteristic in vivo were investigated by histochemistry.ResultsAs the time passed, much osseous island changed large osseous block. It showed that the cells-ceramic compound implanted intramuscularly could be osteogenesis.ConclusionWhen VEGF165 gene was transfected into MSCs, there were blood vessel around the osseous island. VEGF165 could improve vessels growth and accelerate osteogenic of tissue engineering bone. The experiment was an interesting research of vascular tissue engineering bone.

Key words：vascular endothelial growth factor 165; bone marrow stroma cells; β-tricalcium phosphate

骨缺損的治療一直是臨床上棘手的問題。近年來，由種子細胞和生物材料組成的組織工程骨研究進展迅速，為解決骨缺損提供了探索方向。但是，組織工程骨面臨迅速血管化的重要問題，同其他類型移植骨一樣，充分的血液供應是保證組織工程骨在體內存活的決定因素。Ferrara[1]等研究認為VEGF165是體內促進血管生長的主要因子。為此，本實驗將VEGF165基因轉染細胞到骨髓基質細胞中，并就VEGF165影響成骨的特點進行初步探索。

1材料和方法

1.1 試劑與材料：DMEM培養液購自Gibco，限制性核酸內切酶BamH I、Xho I及T4 DNA連接酶，均購自TaKaRa(大連)有限公司。質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒均購自華舜公司。鼠抗人血管內皮生長因子單抗（mAb）購自福建邁新公司。E.coli DH5α、質粒pcDNA3.1及pSP73-VEGF165，均為第四軍醫大學生化教研室李福洋博士惠贈。G418和脂質體LipofectAMINE2000購自Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨髓基質細胞的培養：150g成年雄性SD大鼠12只，3％戊巴比妥鈉腹腔注射全麻后，取左側股骨和脛骨。在超凈臺中將骨髓細胞沖入DMEM培養液中，置入37℃、5%CO2培養箱中培養，24h后換液，以后每隔2天換液1次。第8天，用礦化誘導液培養持續1周，骨髓基質細胞向成骨細胞分化，誘導后的細胞行傳代培養。

1.2.2真核表達載體pcDNA3.1-VEGF165的構建 具體過程詳見文獻[2]。

1.2.3 脂質體介導下VEGF165轉染MSCs：于轉染前1 天，將原代培養的骨髓基質細胞用2.5g/L的胰酶消化、計數，并按1×109 細胞/L 接種于6孔板中。當細胞長滿至90%～95%時，將pcDNA3.1- VEGF165轉染大鼠骨髓基質細胞（同時設立未轉染的空白對照），具體操作按LipofetAMINE2000試劑盒中的說明書進行，將轉染的細胞置于37℃、5%CO2孵箱中培養24h (期間不必換液)。翌日，以G418（300 mg/L）進行篩選，3天換液1次，培養14 天后，獲得陽性細胞克隆。

1.2.4 MSCs與β-磷酸三鈣復合體的構建：將體積為5mm×2mm×2mm的β-磷酸三鈣24塊用蒸餾水洗凈，超聲凈化2次×20min，自然干燥，高壓滅菌。VEGF165基因轉染的MSCs經G418篩選后，將轉染MSCs收集達到所需細胞密度（5×106），種植到β-TCP上。然后，MSCs-β-磷酸三鈣復合體置入37℃、5%CO2孵箱，培養7天，隔日換液。

1.2.5 MSCs-β-磷酸三鈣復合體異位種植：在全麻下將MSCs-β-磷酸三鈣復合體各2塊分別回植到每只大鼠背部的肌肉內，分別于4周、8周及12周各處死大鼠。植入標本經脫鈣、浸蠟、透明、石蠟包埋、連續切片，厚度為5μm，制成組織切片標本，進行HE染色觀察。

2結果

2.1 大鼠骨髓基質細胞的生物學特性：原代培養時，大鼠骨髓基質細胞生長穩定，增殖速度快。原代骨髓基質細胞于24～48h貼壁，開始為小的圓形細胞，培養6～7天時出現90%的融合，呈散在的集落狀生長，并圍繞集落中央呈島狀放射樣排列(圖1)。

2.2G418篩選的陽性細胞克隆：以pcDNA3.1-VEGF165轉染骨髓骨髓基質細胞后24h，加入G418進行篩選。未轉染的細胞在1 周內全部死亡；而轉染的細胞2 周內10%～20%細胞存活，呈克隆狀生長 (圖2) 。

2.3MSCs與β-TCP植入體內的成骨特點：植入體內第4周，可見小骨島，呈散在分布，在小骨島的周圍可見大量的成骨細胞，成骨細胞體積較大，形態不規則。未降解的β-磷酸三鈣在脫鈣時被溶解而余下空白區域(圖3)。植入第8周，標本的成骨量增多，相互融合成片，成骨細胞被包埋在骨基質中，出現板層骨，血管緊貼在新生板層骨周圍（圖4）。植入后12周，移植材料逐漸被新生骨組織取代，成骨量明顯增大，并有骨髓腔樣結構出現，可見骨細胞胞體呈橢圓形，胞核較大，骨陷窩明顯（圖5）。

3討論

如何在構建組織工程化骨組織的同時重建其血液供應成為骨組織工程從基礎研究向臨床應用過渡的關鍵性問題。目前有關骨組織工程血管化的研究尚處于起步階段，主要方法有：①成骨細胞+血管內皮細胞+生物材料；②成骨細胞+生物材料+血管束植入；③成骨細胞+生物材料+筋膜瓣；④成骨細胞+生物材料+帶血管蒂的組織瓣包埋等。Tsurumi等[3]應用VEGF真核表達質粒轉染兔動脈壁，發現側枝循環明顯增加。Baumgartner等[4]進行VEGF基因治療肢體缺血性疾病的臨床試驗，并取得了良好的效果。

研究表明，β-磷酸三鈣（β-TCP）具有良好的骨引導活性，將其植入大鼠股骨上的骨缺損中，術后4天即有細胞侵入材料內部，術后1周時即有骨組織在材料周圍形成，骨直接沉積在材料表面[5]。程曉兵等[6]將塊狀β-TCP埋入兔顱骨骨膜下，觀察其在光滑的骨皮質表面的骨引導作用，結果表明，β-TCP具有良好的表面骨引導作用，新生骨與骨床結合良好。本研究中應用的 -TCP是由荷蘭Isotis生物材料研究所提供的有孔磷酸鈣陶瓷，平均孔徑200μm，含孔率60%。該生物材料是細胞生長良好的載體，它與骨髓基質細胞的三維復合體植入體內后產生較好的異位骨形成能力。

本實驗利用VEGF165的促進微血管生長的作用，將轉染VEGF165的自體骨髓基質細胞作為種子細胞，與β-TCP復合后進行體內成骨能力研究。因轉染細胞數量較少，需將未轉染的骨髓基質細胞與轉染細胞混合，以達到足夠的細胞濃度（≥5×106/ml）。植入后4周，可見移植材料周圍有大量的成骨細胞，并有少量的血管長入；植入后8周，血管緊貼在新生板層骨周圍，成骨量明顯增大，并有骨髓腔樣結構。這些可以說明兩個問題：①骨的形成過程與血管密切相關，如果沒有血管的長入，植入的細胞就無法獲得充分的營養供應，骨形成能力將會受到影響[7]；②轉染VEGF165的骨髓基質細胞在體內生長的同時分泌VEGF165，而分泌的VEGF165促進微血管生長，使植入物周圍的血管盡快長入材料中，從而加速骨形成的過程。MSCs轉染VEGF165基因后植入體內后，可以發揮VEGF165的促血管生長作用，成為組織工程骨血管化探索的方向。但是，VEGF165基因參與成骨的量和方式以及血管化的過程仍需要深入研究。

[參考文獻]

[1]Ferrara N, Henzel WJ. Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothellial cells [J]. Biochem Biophys Res commun, 1989, 161:851-855.

[2]高全文,董紹忠,楊連甲,等.人血管內皮生長因子165基因真核表達載體的構建及表達[J].細胞與分子免疫學雜志,2003,19(1):32-34.

[3]Tsurumi Y, Kearney M, Chen D, et al. Treatment of acute limb ischemia by intramuscular injection of vascular endothelial growth factor gene[J]. Circulation, 1997, 96(suppl Ⅱ):382-386.

[4]Baumgartner I, Pieczek A, Manor O, et al. Constitutive expression of phVEGF165 after intramuscular gene transfer promotes collateral vessel development in patients with critical limb ischemia[J]. Circulation, 1998, 97:1114-1119.

[5]高全文,楊連甲,梁立民,等.大鼠骨髓基質細胞與β-磷酸三鈣體外復合培養[J].現代口腔醫學雜志, 2006,20(2):155-156.

[6]程曉兵,薛振恂,周樹夏,等. 多孔塊狀β-磷酸三鈣陶瓷兔骨膜下埋置引導成骨的定量研究[J]. 實用口腔醫學雜志, 1998, 14(4):256-258.

[7]王金明,章慶國,張嬌.溫固化水凝膠負載骨髓基質干細胞修復兔關節軟骨缺損的實驗研究[J].中國美容醫學,2008,17(3):389-392.

[收稿日期]2008-08-21[修回日期]2008-12-15

編輯/張惠娟