積雪草甙對兔耳增生性瘢痕ＴＧＦ－β１ｍＲＮＡ表達的影響

趙文魯　匡瑞霞　劉　肅　陳　璐

[摘要]目的：通過建立兔耳腹側增生性瘢痕的模型，探討積雪草甙（Asiaticoside,Ad）對TGF-β1 mRNA表達的影響。方法：新西蘭大白兔20只（喂養過程中死亡4只），在兔耳腹側制備直徑為1cm、深達軟骨膜的圓形瘢痕93個，隨機分為4組：空白對照組、得寶松組、低濃度積雪草甙組（25mg/ml）、高濃度積雪草甙組（50mg/ml），分別于瘢痕制備3天后局部應用相應藥物，2周后取材，分別測量瘢痕組織TGF-β1 mRNA的表達量。結果：積雪草甙組與空白對照組相比，TGF-β1mRNA表達量明顯降低，有明顯統計學差異（P<0.01）；積雪草甙與陽性對照組相比，二者mRNA表達量無統計學差異（P>0.05）；積雪草甙組之間，高濃度組與低濃度組相比有統計學差異（P<0.05）。結論：較高濃度積雪草甙注射液局部注射可以減少增生性瘢痕TGF-β1 mRNA的表達。

[關鍵詞]增生性瘢痕瘢痕；積雪草；TGF-β1；熒光PCR

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2009）01-0072-04

Effects of asiaticoside on the expression of TGF-β1 mRNA in hypertrophic scar model of therabbit ears

ZHAO Wen-lu,KUANG Rui-xia,LIU Su，CHEN Lu

(Department of Cosmetic Surgery, the Affiliated Hospital of Medical College Qingdao University, Qingdao 266003,Shandong,China）

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of Asiaticoside on TGF-β1 mRNA expression in hypertrophic scars.MethodsNinety-three full-thickness round wounds (1cm in diameter on ventral side of rabbits ears)on rabbits' ears of 20 rabbits（four died） were created. Then rabbits were randomized into 4 groups: negative group, diprospan group, asiaticoside（25mg/ml）group andasiaticoside（50mg/ml）group. The corresponding injectant were given three days after the scar model was formed lasting for 7days.Samples were collected 2 weeks later and expressions of TGF-β1 mRNA of different groups were detected.ResultsAsiaticoside group has a lower expression of TGF-β1 mRNA compared with negative group（P<0.01），while there are no respective diversity（P>0.05） between asiaticoside group and masculine group. As to the two asiaticoside groups, group of higher concentration has a lower expression of TGF-β1 mRNA and the difference is significant.ConclusionHigher concentration of asiaticoside injected could inhibittheexpressionofTGF-β1 mRNA

Key words: hypertrophic scars; TGF-β1;asiaticoside;quantitative RT-PCR

增生性瘢痕的形成是由于皮膚創傷后的愈合過程中成纖維細胞過量增殖和膠原纖維過度增生的結果，增生性瘢痕的防治是現代醫學的難題之一，尋找治療和預防瘢痕增生的藥物具有重要的意義。積雪草甙為積雪草提取物三萜皂甙的主要成分之一，已有的資料顯示，在各種皮膚損傷修復治療中，無論是在正常創面，還是在延遲愈合的創面中，積雪草甙（Asiaticoside，Ad）均具有促進皮膚損傷修復的藥物活性。臨床上，已有積雪草甙的片劑和霜劑的應用，本實驗是對兔耳增生性瘢痕的局部注射該提取物，通過RT-PCR方法對比研究其前后TGF-β1 mRNA的表達有無統計學差異，進而為臨床上治療增生性瘢痕尋找新的治療途徑。

1材料和方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器：新西蘭大白兔20只，體重2.2～2.7kg，雌雄不拘，購自山東省實驗動物中心，由青島大學醫學院附屬醫院實驗動物中心代為飼養。適應性喂養1周，死亡2只，剩余18只。積雪草甙標準品，由西安市小草植物開發有限公司惠贈； SYBRPremixScript 逆轉錄試劑盒及定量PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；RT-PCR引物： TGF-β1 mRNA 序列取自美國基因庫，引物采用Primer5軟件設計，所有引物由上海生工生物技術有限公司合成（見表2）；冷凍高速離心機(日本Sigama公司)、7500 型熒光定量 PCR 儀(美國Bio-Rad公司)、普通離心機、研磨機、震蕩儀、-70℃冰箱

1.2 兔耳瘢痕模型的制作：氯胺酮和地西泮按分別按2mg/kg和5mg/kg肌肉注射麻醉，然后在兔雙側耳腹側分別作3～4個直徑為1cm的圓形切口，切口間距1cm，完整切除皮膚全層至軟骨膜表面，并切除軟骨膜，保留耳軟骨。創面壓迫止血后予以暴露，無需包扎。術后3天死亡2只，剩余16只，共形成高出正常皮膚的瘢痕塊93個。

隨即選擇每只兔的左右側耳進行藥物對比觀察，分為空白對照組—低濃度積雪草甙組、空白對照組∣高濃度積雪草甙組、空白對照組∣得寶松組、低濃度積雪草甙組∣高濃度積雪草甙組、低濃度積雪草甙組∣得寶松組、高濃度積雪草甙組∣得寶松組；共得到空白對照組19個瘢痕塊、得寶松組22個、低濃度積雪草甙注射組24個（25mg/ml）、高濃度積雪草甙注射組28個（50mg/ml），各組分別于瘢痕制作后3天開始隔天局部注射得寶松和相應濃度積雪草甙藥液0.5ml/個，各組局部藥物注射均持續至瘢痕制作術后10天。于瘢痕制作術后2周切取瘢痕組織標本。

1.3 HE染色：于瘢痕制作2周后切取瘢痕組織，隨即固定于中性甲醛液，常規石蠟包埋，4μm切片，切片常規用二甲苯脫蠟，經各級乙醇至水洗，然后蘇木素染色5min、自來水沖洗，鹽酸鹽酸乙醇化30s，置伊紅液2min，再經常規脫水、透明、封片，鏡檢。

1.4 總RNA的提取：應用TRIzol試劑盒，方法按說明書進行。所提取的總RNA用紫外分光光度計定量，A260/A280值≥1.8的進入下一步實驗。

1.5 實時定量熒光PCR擴增：逆轉錄反應嚴格按照試劑盒操作說明進行；PCR擴增反應體系（20μl）含SYBRPremix ExTaqTM（10μl），PCRForwardPrimer(0.7μl)，PCRReversePrimer(0.7μl)，ROX Reference Dye II(0.4μl)，dH2O(5.1μl)，cDNA(2μl)。反應條件：90℃10s, 94℃5s,60℃45s,共40個循環。 TGF-β1 mRNA 的定量：采用相對定量法。以GAPDH為參照，利用Ct值計算TGF-β1 mRNA 的相對量。TGF-β1 mRNA/GAPDH用下述公式計算：2-△ct。

1.6 統計學方法：采用SPSS11.5統計軟件處理系統，組間差異采用t檢驗進行比較。P<0.05有統計學意義。

2結果

2.1 大體情況：空白對照組瘢痕塊顏色較紅，質地較硬，瘢痕高出皮膚平面，增生范圍未超出原創緣；得寶松組和積雪草甙組瘢痕顏色淡，質軟。如圖1。

2.2 病理結果：HE染色觀察可見，空白對照組毛細血管增生明顯，有大量成纖維細胞，核大、密集，排列不規則；積雪草甙組和得寶松組成纖維細胞數量較少，核較小，排列相對規則。如圖2。

2.3 熒光強度曲線：熒光PCR 儀在PCR 擴增過程中,會自動記錄每一循環的熒光強度,故稱實時熒光PCR ,在最佳實驗條件、相同擴增效率的前提下,反應體系產生一定強度的熒光信號所需的擴增循環數與反應體系中的原始模板數成反比。通過對熒光信號及擴增進程的實時監測,以熒光強度與循環數建立坐標,陽性標本呈現典型的S 形曲線,電泳圖見特異性條帶，而陰性對照呈一條不規則的波浪線。根據各組不同的Ct值算出相應初始cDNA的相對量，應用SPSS11.5統計軟件分析。

2.4核酸初始相對量：根據不同組、不同引物得出不同的熒光標準曲線，根據曲線中的Ct值由上述公式算出相應初始cDNA的相對量（TGF-β1 mRNA / GAPDH mRNA），如表1。

2.5 PCR擴增結果，見表2。

3討論

本實驗采用兔耳瘢痕模型，是基于動物自身對創傷的修復反應與人類病理性瘢痕產生的過程頗為相似。優點是運用這一模型可以對瘢痕組織的產生、發展及轉歸進行動態的連續性的觀察,可隨時留取瘢痕標本,便于對病理性瘢痕組織進行全面系統的研究。國內李薈元[1]等從1998年開始研究兔耳增生性瘢痕模型的建立，成功從20只新西蘭大白兔兔耳腹側面制造增生明顯的瘢痕80余處；李希軍[2]、周勤生[3]等也先后成功復制本模型，成功率高、穩定。我們在實驗模型中制作109處創面，共形成高出正常皮膚表面得增生性瘢痕93個，成功率為85.32%，具備了統計檢驗的標本數量。

本實驗采用SYBR Green染料法，是熒光實時定量 PCR技術的一種，即是在 PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號實時檢測整個 PCR過程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。它是近年來發展起來的一項新的核酸定量技術,其分辨率比傳統 PCR高,定量更準確,受循次數的影響小 ,由于其在擴增的同時采集數據 ,可避免普通PCR后處理對結果的影響。其優點是：①無需設計、合成探針,實驗成本低；②使用方便,與常規 PCR的操作幾乎相同。由于 SYBR Green和雙鏈 DNA是非特異性結合,反應過程中如產生非特異產物、引物二聚體將影響結果的準確性。因此,反應時要設定熔解曲線分析。由圖3b可以看到，本實驗中，溶解曲線均為單一峰，表明無非特異性擴增。

PCR反應過程中產生的 DNA拷貝數最初呈指數方式增加,隨著反應循環數的增加,最終經線性期進入平臺期。參數 Ct值代表達到設定可測熒光閾值的循環數，與樣品中起始模板的拷貝數的對數成線性反比關系。由于Ct值是反映實際 PCR反應過程中擴增即將進入指數期的參數,該參數幾乎不受試劑消耗等因素的影響,因此利用 Ct值可精確判斷起始模板拷貝數。

TGF-β[4]有3種亞型，TGF-β1是首先被發現得有利于傷口愈合得因子，陳偉[5]等研究發現，TGF-β1的持續存在會不斷刺激成纖維細胞誘導基質產生，導致過度的ECM沉積的纖維反應。Hu[6]等研究表明通過使用透明質酸植入得方法降低TGF-β1含量，能夠減少瘢痕形成；Cheng CL[7]等在初步建立兔耳增生性瘢痕模型得基礎上，用組織原位雜交方法，對兔耳增生塊進行了TGF-β1 mRNA檢測，結果各組增生塊組織TGF-β1 mRNA表達均較正常皮膚。另外，張選奮[8]等發現，TGF-β1可以活化蛋白激酶C，在瘢痕形成過程中對于其信號轉導起一定的作用。這個指標是檢測瘢痕形成或者預后的比較好的指標之一，因此我們選用它作為測量指標。

積雪草甙是中草藥積雪草的提取物，為三萜皂甙化合物。陳明春[9]等研究表明，中草藥積雪草能抑制T細胞和巨噬細胞釋放堿性成纖維細胞生長因子，具有抑制成纖維細胞（fibroblast,FB）的增值、促進瘢痕FB凋亡、減少免疫細胞數目、封閉血管、疏松膠原纖維的作用。通過本實驗可以發現，高、低濃度（分別為50mg/ml和25mg/ml）積雪草甙組TGF-β1 mRNA相對量與生理鹽水組相比較，差異均有明顯統計學差異（P<0.05），表明積雪草甙注射液對增生性瘢痕局部內TGF-β1 mRNA有明顯得抑制作用。不同濃度的積雪草甙組間相比較（t檢驗），差異有統計學差異（P<0.05），提示高濃度組能更好地抑制TGF-β1 mRNA的表達；在高濃度積雪草甙組和得寶松組之間的比較中可以發現，二者無明顯差異（P>0.05），提示高濃度積雪草甙具有臨床推廣應用的動物實驗基礎。

本實驗局部應用多種藥物對兔耳瘢痕進行治療，得寶松對于兔耳瘢痕具有較明顯的療效，這與以往的報道基本相同。積雪草甙局部注射可以明顯抑制TGF-β1 mRNA的表達，并且在一定范圍內療效與藥物濃度成正比。與口服積雪草甙片劑相比較，局部注射可以大大減少全身的副作用，而與積雪草甙霜劑相比，局部注射能更大地提高瘢痕局部的藥物濃度。與局部注射糖皮質激素可引起色素脫失、骨質疏松、月經紊亂等相比較，中藥的副作用更小，尤其對于禁忌使用糖皮質激素的患者。因此，積雪草甙瘢痕內局部注射具備臨床推廣的價值。但由于中藥本身成分復雜，其具體作用機理往往是多靶點、多環節地，亟需更深層次的研究為其臨床治療提供有力的依據。

[參考文獻]

[1]李薈元,劉建波,蘭海.建立增生性瘢痕動物模型[J].第四軍醫大學學報，1998，19（6）：655-657.

[2]李希軍,柳大烈,王吉慧.兔耳增生性瘢痕模型建立方法的探討[J].中國美容醫學，2006，5(15)：499-500.

[3]周勤生,馬少林,董祥林.兔耳增生性瘢痕動物模型的建立與應用[J].新疆醫科大報,2005，8（28）：746-748.

[4]Tateshita T, Ono I, Kaneko F , et al. Effect of collagen matrix containing transforming growth factor (TGF)-beta (I) on wound contraction [J].Dermatol Sci 2001，27(2)：104-113.

[5]陳偉,付小兵,葛世麗,等.增生性瘢痕形成和成熟過程中TGF-β1、TGF-β3及其受體的基因表達變化[J].中華整形外科雜志，2004，7（20）：308-309.

[6]Hu M，Sabelman EE，Cao Y，et al．Three-dimensional hyaluronic acid grafts promote healing and reduce scar formation in skin incision wounds[J].J Biomed Mater Res，2003，67B（I）：586.

[7]Cheng CL，Guo JS，Luk J，et a1．The healing effects of Centella extract and asiaticoside on acetic acid induced gastric ulcers in rats［J］．Life Sci,2004，74(18)：2237-2249．

[8]張選奮,郭樹忠,張琳西,等. TGF-β1對兔耳創面肉芽組織和瘢痕組織蛋白激酶C活性的影響[J].中國美容醫學，2004，4（13）：140-142.

[9]陳明春,黃茂芳.積雪草甙和苦參堿對皮膚瘢痕成纖維細胞生長及膠原合成影響的研究[J].中國中西醫結合皮膚性病學雜志，2006，5(1)：11-14.

[收稿日期]2008-09-22[修回日期]2008-12-10

編輯/張惠娟