IL-10\\MMP-9在非小細胞肺癌中的表達及預后的相關性

[摘要] 目的 研究IL-10及MMP-9在非小細胞肺癌中的表達，探討其與NSCLC的浸潤、轉移和預后的關系。方法 采用免疫組織化學法檢測60例非小細胞肺癌及20例肺良性病變組織中IL-10及MMP-9的表達水平;運用單因素(log-rank)生存分析比較IL-10及MMP-9與各臨床特征及預后之間的關系。結果 IL-10及MMP-9在NSCLC中的陽性表達率顯著高于肺良性病變組織(P<0.05)，IL-10及MMP-9表達具有負相關性，同時IL-10低表達組的生存時間要低于高表達組，MMP-9低表達組的生存時間則顯著高于高表達組(P<0.05)，IL-10高表達、MMP-9低表達可能對NSCLC的預后產(chǎn)生影響。結論IL-10及MMP-9在NSCLC中的表達狀態(tài)是NSCLC的影響因素，二者的表達具有相關性，IL-10可能通過抑制MMP-9的表達，抑制腫瘤細胞的轉移。因此，監(jiān)測IL-10及MMP-9的表達對評估NSCLC患者的預后具有重要作用。

[關鍵詞] 非小細胞肺癌;IL-10;MMP-9;免疫組織化學;預后

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A[文章編號] 1673-9701(2009)28-01-04

腫瘤流行病學調查研究顯示，在美國腫瘤已成為死亡的首位原因，發(fā)展中國家，肺癌的發(fā)生率一直呈上升趨勢[1]。非小細胞肺癌(NSCLC)占肺癌患者的80%～85%，其5年生存率僅15%左右[2]，而細胞免疫發(fā)揮著抗腫瘤的主導作用。故探討NSCLC細胞免疫功能狀態(tài)，可能對預測NSCLC患者預后具有重要意義。現(xiàn)應用免疫組化，研究IL-10、MMP-9在NSCLC中的表達情況及其與預后的關系，探討其與肺癌浸潤、轉移的關系及預后意義。

1材料與方法

1.1一般資料

選取南京市胸科醫(yī)院胸外科自1995年以來，所有確診和疑似NSCLC的手術病例60例和20例肺良性病變組織，術前均未做放療或化療，術中均行7～8組以上淋巴結清掃，所有標本送病理科檢查，術后進行系統(tǒng)后續(xù)治療，其中，男性41例，女性19例，年齡37～83歲，中位年齡65歲。所有病例均經(jīng)病理證實，肺癌組織學分類按世界衛(wèi)生組織(WHO)2004年肺癌分類標準，其中鱗癌32例，腺癌22例，6例為其他類型(大細胞癌、鱗腺癌、類癌)。根據(jù)1997年UICC的肺癌TNM分期標準分為I期16例，II期40例，III期4例，伴有淋巴結轉移者44例，無淋巴結轉移者16例。

1.2免疫組化實驗檢測IL-10及MMP-9的表達

全部標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，常規(guī)HE染色。免疫組織化學選用SP法測定，鼠抗人IL-10單克隆抗體、鼠抗人MMP-9單克隆抗體購自美國Biosource公司，光譜超敏SP試劑盒及DAB顯色液等為美國Sigma公司產(chǎn)品。上述標本經(jīng)HE染色和IL-10、MMP-9染色，參照試劑說明書進行免疫組化SP法檢測。

1.3結果判斷

以PBS代替一抗設定為陰性空白對照，同時用已知陽性標本作為陽性對照。IL-10和MMP-9以細胞漿中有黃色顆粒為陽性細胞。蛋白累積的評分方法:參照Fromwitz綜合計分法并略加修改行半定量分析，在400倍光鏡下隨機選擇5個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算陽性細胞百分率。5%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分。著色強度呈淺棕色為1分、棕色為2分、深棕色為3分。綜合評分，<2分為陰性，2~4分為陽性，>4分為強陽性。雙盲法讀片[3]。

1.4統(tǒng)計學分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行分析，兩組間比較采用χ2檢驗，各因素對生存的影響采用Log-Rank 檢驗，生存期按Kaplan-meier方法制作累計生存曲線，影響因素的多因素分析采用COX比例風險模型。結果均以雙側P<0.05為差異有顯著性。

2結果

2.1IL-10及MMP-9在NSCLC中的表達

免疫組化染色顯示IL-10表達位于NSCLC和非肺癌組織的細胞漿中，腫瘤周圍的淋巴細胞偶見IL-10染色;正常支氣管上皮細胞亦可見IL-10染色，而支氣管周圍腺細胞或肺泡上皮細胞未見陽性染色(圖1，2)。MMP-9主要定位于腫瘤細胞胞漿、胞膜、間質的纖維細胞及少量血管內皮細胞，以胞漿多見(圖3)。正常肺泡上皮和支氣管黏膜上皮呈陰性表達。

IL-10在NSCLC和肺良性病變組織中表達的陽性率分別為72%(43/60)、5%(1/20)，可見IL-10在NSCLC組織中的表達顯著高于對照組。NSCLC組織中MMP-9表達的陽性率為60%(36/60)，肺良性病變組織中未見表達。

2.2IL-10、MMP-9在NSCLC組織中表達的相關性

NSCLC組織中IL-10、MMP-9的表達呈負相關(r=0.460，P =0.000)。詳見表1。

2.3NSCLC患者預后的單因素分析

60例NSCLC患者從手術日期開始隨訪，均隨訪4年以上，至患者死亡結束，未死亡者至2009年3月21日截止，中位生存時間34個月。單因素分析顯示，患者年齡、性別、吸煙史及組織學類型的對其生存期均無影響(P>0.05)，詳見表2，而腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期、IL-10及MMP-9表達情況均對患者的生存期有顯著影響(P<0.05);IL-10表達陰性及MMP-9表達陽性的患者生存期明顯縮短(圖4，5)。由此可見IL-10高表達、MMP-9低表達都是NSCLC的預后影響因素。

3討論

NSCLC目前已居人類惡性腫瘤發(fā)生率的前列，外科手術是早中期NSCLC首選的治療方法，但同樣是根治手術，患者的預后仍存在較大差異，而細胞免疫發(fā)揮著抗腫瘤的主導作用，并與體液免疫相互作用，殺傷腫瘤細胞，白細胞介素是在免疫調節(jié)中起關鍵作用的細胞因子，它們與腫瘤發(fā)生的關系愈來愈受到人們的關注，故探討細胞因子與其預后的關系有較大的現(xiàn)實意義。

IL-10是一種免疫抑制細胞因子，體內多種細胞均可以產(chǎn)生，如:正常的新生細胞、腫瘤相關巨噬細胞等，其通過自分泌或旁分泌方式促進腫瘤生長，并抑制細胞程序死亡，調節(jié)腫瘤微環(huán)境，且與肺癌免疫逃逸直接相關。NSCLC患者血漿中IL-10水平明顯升高[4]。本實驗亦發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者IL-10陽性率明顯高于肺良性病變組織，提示腫瘤的生長與IL-10直接相關，腫瘤細胞產(chǎn)生IL-10，通過免疫負性調節(jié)，在腫瘤免疫逃避中起重要作用。Soric研究亦提示，I期NSCLC患者中缺少IL-10的表達提示預后較差[5]。本實驗中，NSCLC腫瘤細胞胞漿中可見IL-10染色強陽性，隨著T分期增加，IL-10的陽性率下降，生存期亦隨之縮短，與Soric等的研究結果一致。但亦有研究提示，在進展期NSCLC患者中，血漿IL-10水平與預后呈負相關[6]，相對于健康志愿者，NSCLC患者中血漿IL-10水平明顯升高，對于治療有效組，IL-10水平明顯下降[7]。提示IL-10作為免疫抑制因子，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，根據(jù)其所處微環(huán)境的不同，發(fā)揮不同的免疫作用，故其參與腫瘤發(fā)展的確切機制尚需進一步研究。

腫瘤浸潤和轉移的先決條件是破壞基底膜的完整性，這一過程為瘤細胞與細胞外基質相互作用的結果，基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPS)是鋅依賴性內切酶超家族，幾乎能夠降解細胞外基質的所有成分，其中MMP-9是MMPS中相對分子質量最大的酶，它以酶原形式分泌，被激活后形成IV型膠原酶，降解細胞外基質和IV、V、VII、X型基底膜膠原，增強腫瘤新生血管的形成，從而促進腫瘤侵襲和轉移。MMP-9在胃癌、NSCLC、肝癌等腫瘤組織中均增高[8]。20%～65% NSCLC病理組織中均發(fā)現(xiàn)有MMP-9[9]，可見MMP-9首先通過破壞腫瘤細胞周圍的物理屏障，使其易于發(fā)生浸潤和轉移。Pinto[10]研究顯示，MMP-9的過度表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。本研究亦表明，MMP-9的陽性表達在NSCLC中明顯高于肺良性病變組織，且隨著TNM分期的增加，MMP9表達的陽性率顯著增高，提示MMP-9參與NSCLC腫瘤轉移的晚期過程，與NSCLC的侵襲和轉移密切相關，可用于評估病情。

腫瘤的轉移同時需伴隨著新生血管的生成。大量實驗證明，癌細胞侵襲轉移能力與其產(chǎn)生或誘導產(chǎn)生細胞外MMPS的能力密切相關。NSCLC病理切片顯示MMP-9表達增加，同時伴隨著新生血管的生成[11]。IL-10可以直接作用于腫瘤細胞或間接作用于浸潤相關的免疫細胞，抑制腫瘤內新生血管形成，抑制腫瘤生長及遠處轉移。小鼠動物模型中，給予IL-10可抑制腫瘤代謝及刺激免疫細胞抗腫瘤免疫反應[11]。Zhang等報道，用非毒性劑量IL-10分別注入實驗性和自發(fā)性腫瘤轉移模型，結果發(fā)現(xiàn)有效抑制了腫瘤的轉移，且呈劑量依賴性。NSCLC中淋巴結轉移患者MMP-9陽性率顯著升高，而IL-10陽性率反而有所下降，二者呈顯著的負相關，提示IL-10的高表達可能通過抑制了MMP-9的產(chǎn)生，抑制腫瘤細胞的浸潤轉移。Stearns等的研究亦有類似發(fā)現(xiàn)，當表達IL-10的人原始前列腺癌細胞被種植到SCID小鼠體內，新生血管生成和轉移受到明顯抑制，更為重要的是，種植表達IL-10腫瘤細胞的小鼠的存活率達到85%[12]。Huang S等[13]報道:將用小鼠IL-10 CDNA轉染的人惡性黑色素瘤細胞移植到裸鼠體內，結果發(fā)現(xiàn)僅有少量肺轉移，并且腫瘤的生長明顯受到抑制。這是由于IL-10抑制了腫瘤新生血管的形成。這些結果與本實驗中IL-10及MMP-9的表達具有一致性的結論相一致。

IL-10與MMP-9均是影響NSCLC患者預后的因素，并且二者表達呈負相關，通過監(jiān)測這兩個指標能夠更加精確的判斷NSCLC患者的預后，值得臨床應用。

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(收稿日期:2009-07-28)