VEGF在Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌患者淋巴結(jié)表達(dá)及臨床意義

[摘要] 目的 通過檢測(cè)I期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者淋巴結(jié)中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)，確定微轉(zhuǎn)移灶的存在及其與腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系。方法 選擇 1999～2007年大連市第五人民醫(yī)院胸外科經(jīng)過根治性手術(shù)(肺葉或全肺切除、系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃術(shù))的常規(guī)病理檢查證實(shí)為Ⅰ期NSCLC患者33例的246枚淋巴結(jié)。所有患者術(shù)前均未接受過放療、化療，均有詳細(xì)完整的臨床隨訪資料。本次研究采用LSAB免疫組化VEGF染色，進(jìn)行光鏡病理學(xué)檢查。結(jié)果 33例患者246枚淋巴結(jié)中有10例(30.3%)患者的12枚(4.9%)淋巴結(jié)中VEGF陽(yáng)性表達(dá)。有或無(wú)VEGF陽(yáng)性表達(dá)的患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(80.0% vs 26.1%，χ2=7.015，P=0.016)，VEGF陽(yáng)性表達(dá)患者的中位生存期顯著短于VEGF 陰性表達(dá)者(21個(gè)月vs. 60個(gè)月，P=0.016);Cox單因素風(fēng)險(xiǎn)模型(P=0.004)和多因素風(fēng)險(xiǎn)模型(P=0.004)均顯示存在淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的I期NSCLC患者預(yù)后不良。結(jié)論 VEGF免疫組化染色檢測(cè)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移與I期NSCLC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)，有助于更加精確的分期，可以作為I期NSCLC患者根治術(shù)后的一個(gè)預(yù)后指標(biāo)，并為其綜合治療提供理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 非小細(xì)胞肺癌; 淋巴結(jié); 微轉(zhuǎn)移;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子; 免疫組織化學(xué)

[中圖分類號(hào)] R734.2[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1673-9701(2009)28-06-03

目前關(guān)于檢測(cè)I期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，評(píng)價(jià)其預(yù)后意義及其對(duì)綜合治療的指導(dǎo)意義研究較少。我們采用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)作為微轉(zhuǎn)移的標(biāo)記物，檢測(cè)I期NSCLC患者的淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移灶。

1材料與方法

1.1病例選擇的標(biāo)準(zhǔn)

選擇1999～2007年大連市第五人民醫(yī)院胸外科經(jīng)過根治性手術(shù)(肺葉或全肺切除、系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃術(shù))的常規(guī)病理檢查證實(shí)為Ⅰ期NSCLC患者33例的246枚淋巴結(jié)。所有患者術(shù)前均未接受過放療、化療，均有詳細(xì)完整的臨床隨訪資料。男19例，女14例;平均年齡56歲(32～68歲)。組織學(xué)類型鱗癌16例、腺癌12例、腺鱗癌5例;病理分期Ia 15例，Ib 18例。

1.2LSAB法免疫組化染色

1.2.1主要試劑兔抗人VEGF-C抗體，VEGFR-3抗體和鼠抗人CD31抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，SP免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)。病理組織切片機(jī)(西德LEICA);生物組織攤片烤片機(jī)(國(guó)產(chǎn)CS-Ⅲ型);自動(dòng)脫水機(jī)(國(guó)產(chǎn)TS-12型)。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色步驟將石蠟包埋組織標(biāo)本置于-4℃冰箱內(nèi)，冷凍后取出，切成2張5μm 厚組織薄片，并置于多聚賴氨酸處理過的載玻片上，經(jīng)攤片、烤片后進(jìn)行VEGF免疫組織化學(xué)染色。將5μm 厚的石蠟切片常規(guī)脫蠟，逐級(jí)水化，先經(jīng)3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，0.01mol/L 枸櫞酸緩沖液行抗原修復(fù)，然后依次加入正常小牛血清(1∶10)，VEGF-C(1∶100)，CD31(1∶100)，VEGFR-3(1∶200)，生物素化羊抗鼠抗體(1∶200)，SP 復(fù)合物(1∶200)。以上各步之間均經(jīng)37℃恒溫箱孵育30min，PBS沖洗(小牛血清除外)，最后DAB染色，DAB顯色:取lmL蒸餾水，加試劑盒中A、B、C試劑1滴，混勻后加至切片，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間在5～30min之間，蒸餾水洗滌。蘇木素輕度復(fù)染;脫水透明，封片，待檢。

1.2.3染色結(jié)果評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)以細(xì)胞膜及細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顯色為陽(yáng)性。只要切片中見到一個(gè)VEGF染色陽(yáng)性的細(xì)胞，就認(rèn)為陽(yáng)性，即淋巴結(jié)中有微轉(zhuǎn)移灶的存在(本實(shí)驗(yàn)是在大連市第五人民醫(yī)院病理科的協(xié)助下完成，參與實(shí)驗(yàn)操作及陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)的2名病理醫(yī)師均對(duì)患者的臨床資料不了解)。

1.2.4實(shí)驗(yàn)對(duì)照以VEGF陽(yáng)性表達(dá)的乳腺癌組織切片為陽(yáng)性對(duì)照，以抗體稀釋液PBS代替第一抗體作為陰性對(duì)照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究的所有數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5軟件包進(jìn)行處理，其中百分比(率)差異性的比較采用Fisher’s精確卡方檢驗(yàn);Kaplan- Meier乘積限法計(jì)算生存率，并繪制生存曲線;Log-rank法比較生存期;Cox回歸模型用于預(yù)后的單因素分析和多因素分析。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生存患者和非腫瘤原因?qū)е碌乃劳龌颊甙磩h失值處理。隨訪方式包括門診隨訪，電話隨訪及信件隨訪等。

2結(jié)果

2.1檢測(cè)淋巴結(jié)中VEGF(+)細(xì)胞

我們采用了33例患者的常規(guī)組織病理檢查陰性的淋巴結(jié)共246枚，其中發(fā)現(xiàn)12枚(4.9%)淋巴結(jié)VEGF染色陽(yáng)性，10例(30.3%)患者淋巴結(jié)VEGF染色陽(yáng)性。單個(gè)或成小細(xì)胞束的VEGF(+)細(xì)胞最常見于淋巴結(jié)的被膜下或髓竇處。見圖1，2。

VEGF(+)細(xì)胞表達(dá)頻率在性別、年齡、組織學(xué)類型、T分期中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2微轉(zhuǎn)移對(duì)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響

截止到2007年4月最后一次隨訪，19例患者無(wú)瘤生存，14例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，其中2例患者局部復(fù)發(fā)但尚生存，12例患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移死亡，這些患者從手術(shù)到復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的中位間隔時(shí)間為21.5個(gè)月。10例淋巴結(jié)VEGF表達(dá)陽(yáng)性的患者中8例(80.0%)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，23例淋巴結(jié)VEGF表達(dá)陰性的患者中6例(26.1%)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，二者之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.015，P=0.016)。

2.3微轉(zhuǎn)移對(duì)生存期的影響

33例患者總的5年生存率為63.6%(21/33)。Kaplan-Meier生存曲線顯示淋巴結(jié)中出現(xiàn)微轉(zhuǎn)移的患者中位生存期顯著短于未出現(xiàn)微轉(zhuǎn)移的患者(21個(gè)月 vs 60個(gè)月，P=0.007)。

2.4單因素和多因素分析結(jié)果

單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)模型顯示病理分期及淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移水平為預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素(P=0.004，相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)=5.06)。

3討論

一般而言，肺癌總的5年生存率為13%，病灶局限組為47%，區(qū)域性擴(kuò)散組的5年生存率僅為17%，而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組的5年生存率僅為1.7%[1]。由此可見，肺癌的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)和其預(yù)后有著肯定的關(guān)系[2]。

1971年Fo1kman發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞能釋放一種能夠誘導(dǎo)血管形成的物質(zhì)，稱之為血管形成因子(Tumor angiogenesis factor，TAF)[3]。1996年Hanahan[4]提出了“血管生成的開關(guān)平衡假說”，即新血管生成的整個(gè)過程受血管生成調(diào)節(jié)因子的嚴(yán)密調(diào)控，血管生成與否取決于血管生成的正性調(diào)節(jié)因子和負(fù)性調(diào)節(jié)因子之間力量的對(duì)比。目前已分離純化了20多種正性調(diào)節(jié)因子及相關(guān)因子，如VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)、bPGF(堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、aFGF(酸性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、PD-KCGF (血小板源性內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、TGF-β(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β)等，其中以VEGF作用最強(qiáng)、特異性最高[5]。VEGF又名血管通透性因子(Vascular permeability factor，VPF)，是1983年Senger等首先在豚鼠腫瘤腹腔滲液及多種腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)，隨后1989年Leung 等從牛垂體濾泡細(xì)胞培養(yǎng)液中分離出并加以證實(shí)[6]。O’Byrne等[7]報(bào)道VEGF與非小細(xì)胞肺癌腫瘤血管生成關(guān)系密切。

非小細(xì)胞肺癌與其他實(shí)體腫瘤一樣，其生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴瘤體內(nèi)血管的形成。腫瘤血管形成不僅是腫瘤生長(zhǎng)所必需，而且是腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的必需條件。腫瘤在經(jīng)歷生長(zhǎng)緩慢的血管前期而進(jìn)入血管期后，生長(zhǎng)迅速，呈指數(shù)性生長(zhǎng)，且新生毛細(xì)血管基底膜呈節(jié)段性分布，比正常組織的成熟毛細(xì)血管對(duì)瘤細(xì)胞有更高的親和性，更加促進(jìn)了瘤細(xì)胞向循環(huán)系統(tǒng)入侵，是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一[8]。

腫瘤淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移一般是指惡性腫瘤細(xì)胞在發(fā)展過程中，播散并存活于淋巴結(jié)中，尚未形成顯性轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，轉(zhuǎn)移部位也無(wú)任何臨床表現(xiàn)，常規(guī)檢查方法如影像學(xué)和臨床病理學(xué)等均難以檢測(cè)發(fā)現(xiàn)出一種微量轉(zhuǎn)移特征。診斷淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的標(biāo)準(zhǔn)是在常規(guī)病理學(xué)檢查為陰性的受檢淋巴結(jié)中，經(jīng)現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)診斷為陽(yáng)性者或在免疫組化染色的淋巴結(jié)組織石蠟切片中出現(xiàn)散在的單個(gè)細(xì)胞或長(zhǎng)度≤2mm 的腫瘤細(xì)胞束[9]。

我們的研究發(fā)現(xiàn)VEGF免疫組化染色檢測(cè)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移與I期NSCLC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)，10例淋巴結(jié)中VEGF表達(dá)陽(yáng)性的患者中8例(80.0%)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，23例淋巴結(jié)中CK表達(dá)陰性的患者中6例(26.1%)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 7.015，P=0.016)。

淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移也與I期NSCLC預(yù)后相關(guān):本研究中33例患者總的5年生存率為63.6%。Kaplan-Meier生存曲線顯示淋巴結(jié)中出現(xiàn)微轉(zhuǎn)移的患者中位生存期(21個(gè)月)顯著短于未出現(xiàn)微轉(zhuǎn)移的患者中位生存期(60個(gè)月，P=0.007)。單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)模型顯示T分期及淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移水平均為預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素(P=0.045，0.004)。多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)模(Backward:LR method)顯示淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移水平是I期NSCI C患者的獨(dú)立預(yù)后因素(P=0.004)。

淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的I期NSCLC患者較淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移陰性的患者容易復(fù)發(fā)、生存期短。而目前分期未考慮淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的因素，故不能精確反映疾病的狀態(tài)。到目前為止，對(duì)NSCLC的淋巴結(jié)(N)分期仍主要依賴于受檢淋巴結(jié)的切片HE染色的結(jié)果。僅憑這種方法，那些隱藏在淋巴組織或淋巴竇中的單個(gè)腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞束，甚至一些較小的轉(zhuǎn)移巢均很容易被遺漏掉，這就導(dǎo)致部分NSCLC患者的TNM分期過低，因此檢測(cè)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移灶還有利于I期NSCLC的精確分期。

對(duì)I期NSCLC患者的治療首選手術(shù)切除。對(duì)I期NSCLC術(shù)后是否需要輔助化療，目前觀點(diǎn)尚不一致。一般認(rèn)為對(duì)I期NSCLC，局部控制是主要問題，單純外科治療就能達(dá)到根治的目的，沒有必要應(yīng)用輔助化療。隨著淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移研究的深入，對(duì)微轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的I期NSCLC患者根治術(shù)后實(shí)施輔助化療的必要性越來(lái)越引人關(guān)注。Hamada等[10]對(duì)日本國(guó)內(nèi)以優(yōu)福定作為輔助化療方案的9個(gè)隨機(jī)試驗(yàn)(1923名I期NSCIC患者)進(jìn)行Meta分析，結(jié)果為接受肺癌根治術(shù)+優(yōu)福定輔助化療組患者的5年、7年生存率(81.0%和76.5%)均高于單純手術(shù)組患者(77.2%和69.5%，P=0.011，0.001)，提示I期肺腺癌患者根治術(shù)后接受優(yōu)福定輔助化療可以提高5年、7年生存率。Berghmans等[11]對(duì)1965～2004年間以英文和法文發(fā)表的19個(gè)關(guān)于輔助化療的隨機(jī)試驗(yàn)進(jìn)行Meta分析，結(jié)果表明對(duì)經(jīng)過肺癌根治術(shù)的I期NSCIC患者進(jìn)行輔助化療，可以有效提高患者的生存期(HR 0.88，95%C1 0.48～1.93)。這為I期NSClC的綜合治療，尤其是淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者術(shù)后輔助化療提供了理論依據(jù)。

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(收稿日期:2009-05-07)