DNA的提取及鑒定

摘要由于DNA容易變性，為了獲得和天然DNA結(jié)構(gòu)相似的大分子DNA，必須嚴(yán)格控制實驗條件，同時還要抑制脫氧核糖核酸酶的作用。在提取液中加入整合劑檸檬酸鈉和EDTA，使之與脫氧核糖核酸酶的輔因子Ca2+和Mg2+結(jié)合，使核酸酶喪失活性。十二烷基磺酸鈉(也稱SDS)為去污劑，可以破壞細(xì)胞膜，也可以使核酸酶喪失活性。

關(guān)鍵詞DNAEDTASDS

中圖分類號:Q78文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

DNA以核蛋白形式存在于細(xì)胞核中，制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分離，又要保持DNA分子的完整。蛋白酶K及鏈霉蛋白酶E的應(yīng)用使這兩個原則得到了保證。蛋白酶K或鏈霉蛋白酶E均為廣譜蛋白質(zhì)，其重要特性是能在SDS(十二烷基硫酸鈉)和EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)存在下保持很高的活性。在勻漿后提取DNA的反應(yīng)體系中，SDS可破壞細(xì)胞膜、核膜，蛋白酶E可將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來。加入氯仿/異戊醇抽提除去蛋白質(zhì)，最后用無水乙醇沉淀DNA。在提取過程中，染色體會發(fā)生機(jī)械斷裂，產(chǎn)生大小不同的片段，因此分離基因組DNA時應(yīng)盡量采取溫和條件，以保證得到較長的DNA。

1材料與儀器

1.1 材料

(1)雞肝。

(2)氯仿/異戊醇=24:1。

(3)75%乙醇、90%乙醇、無水乙醇。

(4)1€譙SC溶液:0.15mol/L氯化鈉—0.015mol/L檸檬酸鈉溶液，pH7.0。

(5)0.15mol/L氯化鈉—0.1mol/LNa2EDTA溶液，pH8.0。

(6)5%SDS溶液:把5gSDS溶于100 mL45%的乙醇中。

(7)二苯胺試劑:將1g純的二苯胺溶于98 mL的冰乙酸中，再加入2 mL濃H2SO4，此溶液須新鮮配制。

(8)DNA溶液:把100mg脫氧核糖核酸溶解于100 mL蒸餾水中。

1.2 儀器

(1)組織搗碎勻漿機(jī)。

(2)離心機(jī)。

(3)天平。

2 方法

2.1 DNA的提取

(1)稱取80g新鮮的雞肝，剪成小塊，放入盛有大約150ml預(yù)冷的1€譙SC溶液的燒杯中洗大約5分鐘，倒掉緩沖液，再加入大約150ml預(yù)冷的1€譙SC溶液洗2～3次，使血量減少。……