DNA的提取及鑒定

摘要由于DNA容易變性，為了獲得和天然DNA結構相似的大分子DNA，必須嚴格控制實驗條件，同時還要抑制脫氧核糖核酸酶的作用。在提取液中加入整合劑檸檬酸鈉和EDTA，使之與脫氧核糖核酸酶的輔因子Ca2+和Mg2+結合，使核酸酶喪失活性。十二烷基磺酸鈉(也稱SDS)為去污劑，可以破壞細胞膜，也可以使核酸酶喪失活性。

關鍵詞DNAEDTASDS

中圖分類號:Q78文獻標識碼:A

DNA以核蛋白形式存在于細胞核中，制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質、脂類和糖類等分離，又要保持DNA分子的完整。蛋白酶K及鏈霉蛋白酶E的應用使這兩個原則得到了保證。蛋白酶K或鏈霉蛋白酶E均為廣譜蛋白質，其重要特性是能在SDS(十二烷基硫酸鈉)和EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)存在下保持很高的活性。在勻漿后提取DNA的反應體系中，SDS可破壞細胞膜、核膜，蛋白酶E可將蛋白質降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來。加入氯仿/異戊醇抽提除去蛋白質，最后用無水乙醇沉淀DNA。在提取過程中，染色體會發生機械斷裂，產生大小不同的片段，因此分離基因組DNA時應盡量采取溫和條件，以保證得到較長的DNA。

1材料與儀器

1.1 材料

(1)雞肝。

(2)氯仿/異戊醇=24:1。

(3)75%乙醇、90%乙醇、無水乙醇。

(4)1€譙SC溶液:0.15mol/L氯化鈉—0.015mol/L檸檬酸鈉溶液，pH7.0。

(5)0.15mol/L氯化鈉—0.1mol/LNa2EDTA溶液，pH8.0。

(6)5%SDS溶液:把5gSDS溶于100 mL45%的乙醇中。

(7)二苯胺試劑:將1g純的二苯胺溶于98 mL的冰乙酸中，再加入2 mL濃H2SO4，此溶液須新鮮配制。

(8)DNA溶液:把100mg脫氧核糖核酸溶解于100 mL蒸餾水中。

1.2 儀器

(1)組織搗碎勻漿機。

(2)離心機。

(3)天平。

2 方法

2.1 DNA的提取

(1)稱取80g新鮮的雞肝，剪成小塊，放入盛有大約150ml預冷的1€譙SC溶液的燒杯中洗大約5分鐘，倒掉緩沖液，再加入大約150ml預冷的1€譙SC溶液洗2～3次，使血量減少。

(2)把洗凈的雞肝放入組織搗碎勻漿機中，加入約2倍體積1€譙SC溶液勻漿1～2分鐘。

(3)取勻漿液20ml，在3500r/min下離心10min，倒掉上清液(注:記錄上清液的體積)。

(4)將離心后所得的沉淀(20 ml減去上清液的體積即為沉淀量)均勻懸浮于5倍體積的0.15mol/L氯化鈉—0.1mol/LNa2EDTA溶液中，邊攪拌邊滴加5%SDS溶液，直到SDS的最終濃度達1%為止。

(5)在劇烈攪拌下加入已經磨碎的固體氯化鈉使其最終濃度達到1mol/L，繼續攪拌30分鐘直到氯化鈉完全溶解為止。

(6)把上述混合液倒入一個試劑瓶內，加入等體積氯仿/異戊醇混合液，在室溫下激烈振蕩20分鐘。

(7)在3000r/min轉速下，將上述懸濁液離心30min。

(8)離心后，小心吸取凝聚的蛋白質上部的水層(DNA在水相)，蛋白質在水相和有機相之間，把吸出的上層水相倒入一個250ml的燒杯中。

(9)用一支干凈的玻璃棒慢慢攪動下緩緩加入2倍體積預冷的95%乙醇。乙醇加入后，沿一個方向連續的攪拌，使其充分混合，以便使絲狀DNA纏繞于玻璃棒上。

(10)將繞出的DNA放入75%的乙醇中洗一次，然后放入95%的乙醇中洗一次，最后再放入無水乙醇中洗一次。

(11)將提取的DNA樣品轉入試管中，加入適量的水溶解備用(記下總體積)。

2.2DNA的鑒定

取兩支試管，分別加入5毫升的DNA標準溶液和2毫升雞肝DNA溶液，再各加入2毫升二苯胺試劑，混合均勻，在沸水浴中加熱10分鐘，將試管冷卻。冷卻后加入二苯胺的試管溶液均變藍(深藍)，說明含大量DNA。溶液顏色的深淺與DNA的含量有關。

3結論與分析

(1)幾乎所有的細胞中都含有DNA。但是有些組織細胞中DNA的含量很少，不適合作為制備DNA的材料。此外，在有些組織中，脫氧核糖核酸酶的活性很高，所以在這些組織細胞中的大分子DNA都已經斷裂為小的碎片。因此，從組織細胞中制備DNA選擇DNA含量多而脫氧核糖核酸酶活性低的組織。具備這些最好的組織是胸腺、淋巴組織，脾臟、肝也是理想的材料。本實驗選用的組織是新鮮的雞肝。實驗證明，新鮮的雞肝提取的DNA量多、鏈長且不易斷裂;將剛取出的新鮮雞肝急速冷凍后再提取的DNA的效果也可以，但不如新鮮的雞肝提取出的DNA的量多;不新鮮的冷凍過的雞肝提取的DNA量少、鏈短且易斷裂。

(2)細胞內核酸都是與蛋白質結合而呈核蛋白的形式，所以在制備核酸時，先設法破碎細胞，然后再將蛋白質與核算相分離。在提取液中加入整合劑檸檬酸鈉和EDTA(乙二胺四乙酸)，使之與脫氧核糖核酸酶的輔因子Ca2+和Mg2+結合，使核酸酶喪失活性。十二烷基磺酸鈉(也稱SDS)為去污劑，可以破壞細胞膜，也可以使核酸酶喪失活性，本實驗采用較高濃度的SDS，與蛋白酶K處理細胞以促使細胞及細胞核破裂。

(3)乙醇對酶的活性有抑制作用，所以在提取DNA時要盡量去除乙醇，以免影響蛋白酶K的活性。因此在提取DNA時，首先要進行離心，將含有較多乙醇的上清液除去。將離心后所得的沉淀均勻懸浮于5倍體積的0.15mol/L氯化鈉—0.1mol/LNa2EDTA溶液中，在劇烈攪拌下加入已經磨碎的固體氯化鈉使其最終濃度達到1mol/L，繼續攪拌30分鐘直到氯化鈉完全溶解為止。一方面溶解稀釋殘余的乙醇，另一方面為肝細胞提供近似的生理溶液環境，取得了較理想的效果。

(4)脫氧核糖核酸和蛋白質結合形成的復合物成為脫氧核糖核蛋白(簡稱DNP)，DNP溶于高離子強度的溶液中，但不溶于低離子強度(0.05～0.25mol/L)的溶液中。利用這一性質，在提取的最初階段，首先把組織細胞放于檸檬酸鈉的等滲鹽溶液中勻漿(pH為7.0)，此時，大多數其他的大分子物質如核糖核蛋白(RNP)處于溶解狀態，而脫氧核糖核蛋白(DNP)不溶，分離沉淀物，將其溶解于1 mol/L的鹽中。加入氯仿/異戊醇抽提除去蛋白質，向抽提液中加入乙醇可沉淀出DNA。

(5)DNA的鑒定采用二苯胺鑒定法。DNA分子中2-脫氧核糖殘基在酸性溶液中加熱降解，產生2-脫氧核糖并形成€%r-羥基-€%\\-酮基戊酸，后者與二苯胺試劑反應產生藍色化合物，其反應如下圖。

藍色化合物在595nm處有最大吸收，且DNA在40€%eg ~400€%eg范圍內時，吸光度與DNA濃度成正比。在反應液中加入少量乙醛，可以提高反應靈敏度。