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DNA的提取及鑒定

2009-04-29 00:00:00趙連梅張春青
科教導(dǎo)刊 2009年9期

摘要由于DNA容易變性,為了獲得和天然DNA結(jié)構(gòu)相似的大分子DNA,必須嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件,同時(shí)還要抑制脫氧核糖核酸酶的作用。在提取液中加入整合劑檸檬酸鈉和EDTA,使之與脫氧核糖核酸酶的輔因子Ca2+和Mg2+結(jié)合,使核酸酶喪失活性。十二烷基磺酸鈉(也稱(chēng)SDS)為去污劑,可以破壞細(xì)胞膜,也可以使核酸酶喪失活性。

關(guān)鍵詞DNAEDTASDS

中圖分類(lèi)號(hào):Q78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

DNA以核蛋白形式存在于細(xì)胞核中,制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和糖類(lèi)等分離,又要保持DNA分子的完整。蛋白酶K及鏈霉蛋白酶E的應(yīng)用使這兩個(gè)原則得到了保證。蛋白酶K或鏈霉蛋白酶E均為廣譜蛋白質(zhì),其重要特性是能在SDS(十二烷基硫酸鈉)和EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)存在下保持很高的活性。在勻漿后提取DNA的反應(yīng)體系中,SDS可破壞細(xì)胞膜、核膜,蛋白酶E可將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地分離出來(lái)。加入氯仿/異戊醇抽提除去蛋白質(zhì),最后用無(wú)水乙醇沉淀DNA。在提取過(guò)程中,染色體會(huì)發(fā)生機(jī)械斷裂,產(chǎn)生大小不同的片段,因此分離基因組DNA時(shí)應(yīng)盡量采取溫和條件,以保證得到較長(zhǎng)的DNA。

1材料與儀器

1.1 材料

(1)雞肝。

(2)氯仿/異戊醇=24:1。

(3)75%乙醇、90%乙醇、無(wú)水乙醇。

(4)1€譙SC溶液:0.15mol/L氯化鈉—0.015mol/L檸檬酸鈉溶液,pH7.0。

(5)0.15mol/L氯化鈉—0.1mol/LNa2EDTA溶液,pH8.0。

(6)5%SDS溶液:把5gSDS溶于100 mL45%的乙醇中。

(7)二苯胺試劑:將1g純的二苯胺溶于98 mL的冰乙酸中,再加入2 mL濃H2SO4,此溶液須新鮮配制。

(8)DNA溶液:把100mg脫氧核糖核酸溶解于100 mL蒸餾水中。

1.2 儀器

(1)組織搗碎勻漿機(jī)。

(2)離心機(jī)。

(3)天平。

2 方法

2.1 DNA的提取

(1)稱(chēng)取80g新鮮的雞肝,剪成小塊,放入盛有大約150ml預(yù)冷的1€譙SC溶液的燒杯中洗大約5分鐘,倒掉緩沖液,再加入大約150ml預(yù)冷的1€譙SC溶液洗2~3次,使血量減少。……

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