糖尿病大鼠腦缺血再灌注腦組織ＢＤＮＦ表達及ＵＰＰ阻斷的影響

[摘要] 目的 探討糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注模型中腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)的表達及阻斷泛素蛋白酶體途徑(UPP)對它的影響。方法 將SD大鼠隨機分成正常對照組(A組)、假手術組(B組)、非糖尿病組(C組)、糖尿病組(D組)和糖尿病治療組(E組)，免疫組織化學方法觀察再灌注3h、6h、24h、48h及阻斷UPP后腦組織中BDNF的動態(tài)變化。結果 腦缺血再灌注后，各腦梗死組BDNF表達均增加，24h達高峰，48h后下降; UPP阻斷后E組腦組織中BDNF陽性細胞計數(shù)較C組、D組明顯增加(P<0.05)。結論 UPP阻斷可通過促進內源性BDNF表達產生神經保護作用。

[關鍵詞] 腦缺血再灌注; UPP; BDNF; 神經保護

[中圖分類號] R365.54 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2009)27-01-03

BDNF Expression in Focal Cerebral Ischemin-reperfusion in Diabetic Rat and Impact of Blocking Ubiquitin Proteasome Pathway

JIANG Xianping1 LIU Fang2

1.Qiannan People’s Hospital，Duyun 558000，China;2.Department of Neurology，the Affiliated Hospital of Guiyang Medical College，Guiyang 550004，China

[Abstract] ObjectiveTo study the expression of brain-derived neurotrophic factor(BDNF)in focal cerebral ischemin of diabertic rat modleand the impact of blooking ubiquitin proteasome pathway(UPP). MethodsSprague-Dawley rats were randomly divided into control group(group A)，sham operation group(group B)，non-diabetes cerebral infarction group(group C)，diabetes cerebral infarction group(group D)and diabetes cerebral infarction treatment group(group E)，and we observed the expression variation ofBDNF at 3h，6h，24h and 48h and blooking UPP after reperfusion by immunohistochemistry. ResultsThe BDNF expression was increased in every group after ischemic and reperfusion and peaked at 24h and descented at 48h.The brain positive cell count in the group E was increased than that in the group D(P<0.05) after blooking UPP. ConclusionBlocking UPP can produce neuroproctection by promoting the endogenous expression of BDNF.

[Key words]Cerebral ischemia-reperfusion; Blooking ubiquitin proteasome pathway; Brain-derived neurotrophic factor; Neuroproctection

目前，糖尿病已被公認是引起腦梗死的獨立危險因素之一。流行病學研究顯示，糖尿病患者合并腦血管疾病是非糖尿病患者的2～4倍[1]，且糖尿病缺血性腦血管病占糖尿病性腦血管病變的88%[2]。腦卒中死亡的患者中，糖尿病是非糖尿病患者的2倍以上[3]。目前認為，在腦缺血及腦缺血再灌注損傷過程中可能會激活機體內源性保護因子的表達，腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是其中一種重要的因子之一。UPP(ubiquitin proteasome pathway)參與了缺血性腦損傷的病理學過程，高血糖和糖尿病也可通過UPP加重缺血再灌注損傷。

有證據表明，通過干預 UPP 能夠有效減輕腦缺血后的炎癥反應和再灌注損傷[4]。但是予以UPP阻斷后是否可以上調BDNF的表達、加強BDNF的腦保護作用，國內外還未見報道。因此我們建立糖尿病腦梗死模型，對其采取UPP阻斷，觀察缺血再灌注后BDNF的表達，探討阻斷UPP與BDNF表達之間的關系，進一步探討糖尿病性腦血管病的發(fā)病機制，以期為臨床預防、治療糖尿病腦梗死提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 試劑與藥品

STZ(美國公司生產)，clasto-lactacystin 13-lactone(ALEsix公司，Switzer-land);SABC免疫組化試劑盒，DAB顯色劑，I抗BDNF等均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 實驗動物分組

健康雄性SD大鼠84只，體重(250±20)g，隨機分正常對照組6只(A組)，假手術組6只(B組)，非糖尿病腦梗死組24只 (C組)，糖尿病腦梗死組24只(D組)，糖尿病腦梗死治療組24只(E組)。

A組為正常大鼠，無任何處理。B組只作插線不作栓塞，C組只作缺血再灌注模型，D組和E組均先制作糖尿病模型后再制作缺血再灌注模型，每組根據再灌注時間又分為再灌注3h、6h、24h、48h亞組(每亞組6只)。

1.3 動物模型

1.3.1 糖尿病模型 大鼠適應性喂養(yǎng)一周后，隨機選取48只作糖尿病模型。2%鏈脈佐菌素(STZ)按60mg/kg給大鼠腹腔注射，48h后取鼠尾微量血測空腹(禁食、禁水10h)血糖達 16.7mmol/L以上的大鼠常規(guī)喂養(yǎng)6周，每周復測隨機血糖在13.5mmol/L[5，6]以上即可確診糖尿病，入選作腦梗死再灌注模型。對血糖值<16.7mmol/L的大鼠適量補充注射鏈脲霉素1～5mg/只，并于補藥3d后再次檢測血糖值，及時淘汰未達標大鼠。

1.3.2 局灶性腦缺血再灌注模型(MCAO法) 糖尿病模型制作成功后，C、D、E三組參考 Nagasawa[7]方法制作 MCAO(大腦中動脈閉塞 )模型。缺血時間為2h，再灌注時輕輕提拉所留線頭。B組的手術過程相同，只是線栓長度為10mm，只置于頸內動脈而未進入大腦中動脈。

1.3.3 糖尿病腦梗死治療模型 糖尿病腦梗死再灌注模型建立后，在缺血2h再灌注時按0.03mg/kg大鼠尾靜脈注射clasto-lactacystin β-lactone。

1.3.4 MCAO模型神經功能評分 根據Longa等[8]報道的神經功能缺陷5分制標準，待大鼠麻醉蘇醒后進行神經功能評分。1～3分為模型制作成功。制作成功的大鼠進行下一步實驗。不具備上述體征及術后未生存至預定時間點的大鼠被淘汰。

1.4 取材及免疫組化染色

各組根據不同亞組的再灌注時間點，將大鼠深麻醉，經4%多聚甲醛PBS緩沖液灌注固定后 ，斷頭取腦。取視交叉后 2mm 腦組織層面進行脫水、石蠟包埋、切片4μm。免疫組化采用標準SABC法，DAB顯色，按試劑盒說明進行操作，免疫染色陰性對照采用PBS液代替I抗。在額頂葉皮質，用Image-pro Plus 5.0圖文分析系統(tǒng)測定BDNF免疫陽性細胞計數(shù)。每張切片用高倍鏡(×200)隨機觀測皮質到白質5個不重復視野，計算BDNF免疫陽性細胞計數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據以χ±s表示，成組設計多樣本均數(shù)比較用one-way ANOVA方差分析，多樣本均數(shù)間兩兩比較用LSD法，檢驗水準為(P = 0.05)，應用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行分析。

2 結果

2.1 腦梗死各組不同時間點神經功能評分比較

見表1。A組、B組無神經功能受損，C、D、E三組在MACO術前Longa評分差異無統(tǒng)計學意義。各缺血時間點上D組神經功能評分較其他各腦梗死組高，差異有顯著性(P<0.05);E組的神經功能評分較C組、D組低，差異有顯著性(P<0.05)。

2.2 免疫組化結果

免疫組化檢測提示在A組中有BDNF陽性細胞(圖中箭頭所示)表達(見封三圖1)。

BDNF免疫陽性細胞主要分布在皮層Ⅲ～Ⅴ層神經細胞，在缺血灶周圍也有少量表達，胞漿和突起被染成棕黃色，主干樹突和近細胞膜的胞漿處染色較深，而細胞核周圍染色較淺。

各腦缺血組缺血2h再灌注后不同時間點BDNF的表達比較見表2。由表2可見，缺血再灌注6h后各組、各時間點上BDNF表達較正常對照組增加(P<0.05)，24h達到高峰(見封三圖2-4)，48h下降(見封三圖5-7);D組BDNF表達較C組低(P<0.05);E組BDNF表達較C組、D組增加(P<0.05)。

3 討論

大量研究證實，糖尿病可通過多元醇途徑、蛋白激酶C(protein kinaseC，PKC)活化、氧化應激等途徑加重腦缺血再灌注損傷。Li[9]用形態(tài)學方法研究證明，腦缺血前，短時間及長時間的高血糖對腦組織都有損害作用。Bomont[10]發(fā)現(xiàn)MCAO 后 48h高血糖、糖尿病分別使梗死體積增大 46%、68%。Wand[11]利用MCAO再灌注模型觀察糖尿病對細胞死亡的影響，發(fā)現(xiàn)糖尿病能使細胞凋亡和死亡的過程加重。本研究顯示，各缺血時間點上糖尿病腦梗死組神經功能評分較非糖尿病腦梗死組高，差異有顯著性。該結果說明高血糖可加重腦缺血再灌注損傷，使大量神經細胞凋亡、死亡，使神經功能受損嚴重，評分增加。而糖尿病治療組通過阻斷UPP途徑，使炎癥反應減輕，腦缺血再灌注損傷減輕，神經功能缺損也相應減輕，本研究中糖尿病治療組的神經功能評分較糖尿病組低也表明阻斷UPP途徑能減輕腦缺血再灌注損傷。

眾多的研究表明，BDNF參與腦缺血損傷的保護過程，可促進神經元的存活和突觸生長，減少神經元的退行性變和抗凋亡作用[12-15]。BDNF是神經營養(yǎng)因子家族中的一種，主要在中樞神經系統(tǒng)內表達，大多分布在海馬、杏仁核和皮質，也存在于紋狀體、基底前腦、丘腦、腦干和小腦。本實驗顯示，正常大鼠皮質有BDNF免疫陽性細胞少量表達，這可能是腦組織對抗正常生理性老化的反應。

本研究顯示在缺血、缺氧的情況下，BDNF表達大量增加。本研究中假手術組BDNF的表達較正常對照組增加，說明不僅在缺血、缺氧情況下可以引起B(yǎng)DNF高表達，手術刺激也可以引起B(yǎng)DNF表達增加。但假手術組BDNF的增加遠遠低于各腦梗死組，此結果與Yang[16]的報道一致。

本研究還顯示，在腦缺血后6h各組 BDNF表達開始大量增加，且在24h達高峰，48h開始下降，表明BNDF在神經元損傷修復與再生中起重要作用。此結果與王魯民[17]、徐正東[18]等許多國內學者的研究結果相同。

大量研究證實BNDF對神經元損傷修復與再生起重要作用。Ding[19]應用短暫大腦中動脈缺血模型研究顯示，運動能增加腦內BDNF的表達，同時能減少梗死體積，說明梗死體積的減小可能與內源性BDNF的表達增多有關。Yanamoto[20]用重組BDNF腦內注射的方法，研究注射BDNF與對照組及注射生理鹽水組梗死體積及局部血流變化，發(fā)現(xiàn)注射BDNF組的梗死體積較其他兩組明顯減小，并隨著注藥時間的延長，梗死體積減小的越明顯。

本研究結果顯示，糖尿病腦梗死組缺血再灌注后BDNF表達較非糖尿病腦梗死組減少，神經功能評分增加(P<0.05)，該結果說明高血糖可抑制BDNF的表達。BDNF的表達減少使其對神經元的修復和再生作用也受到抑制，過多的神經元細胞死亡和凋亡又使內源性的BDNF自分泌減少，造成惡性循環(huán)。因此該抑制作用可能為糖尿病加重腦缺血再灌注后神經細胞死亡和凋亡的機制之一[21-24]。

目前認為，泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)參與了缺血性腦損傷的病理學過程，UPP是一個調節(jié)蛋白質降解的重要系統(tǒng)[4]，26S蛋白酶體是其重要成分之一。Clasto lactacystinβ-lactone是合成產物，其天然產物為 lactacystin，其活性中間體β-lactone能選擇性不可逆地與26S蛋白酶體催化核心 20S上的蘇氨酸結合，從而抑制26S蛋白酶體的活性，阻斷 UPP參與的缺血再灌注損傷。

本研究顯示，予UPP阻斷后，可見到糖尿病腦梗死治療組BDNF表達較非糖尿病腦梗死組、糖尿病腦梗死組明顯增加，神經功能評分降低(P<0.05)。其原因可能是UPP阻斷抑制了糖尿病對腦缺血再灌注的損傷，減少神經元細胞的死亡和凋亡，幸免受損的神經細胞在缺血、缺氧的刺激下增加了內源性BDNF表達而達到神經保護作用。

因此，我們認為UPP阻斷后，可阻斷糖尿病對腦缺血再灌注后的損傷通路，減少神經細胞凋亡和死亡，使內源性的BDNF表達增加，進一步達到神經保護的目的。

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(收稿日期:2009-07-30)