七氟醚對大鼠缺血再灌注心肌凋亡相關基因表達的影響

陳根殷　王旭光　楊　展　陳淑瓊

【摘要】 目的 探討七氟醚預處理對大鼠心臟缺血再灌注過程中心肌細胞Bcl-2及Bax 基因表達的影響。方法 24只SD大鼠隨機分成3組(n=8)：假手術對照組(C組)、缺血再灌注對照組(IR組)和七氟醚預處理組(s組)。IR組與S組接受左冠脈3 h阻斷和3 h再灌注。七氟醚預處理組在缺血前吸入七氟醚，30 min后洗脫15 min。取心肌缺血區組織，RT-PCR測Bcl-2及Bax基因的mRNA表達，免疫印跡法(Western-blot)測蛋白表達。結果 與C組相比較，IR組和S組Bcl-2的mRNA和蛋白表達均下調，而S組高于IR組；Bax的mRNA和蛋白表達IR及S組均高于C組，IR組則高于S組。結論 七氟醚預處理抑制心肌細胞凋亡可能與上調Bd-2基因的表達、下調Bax基因的表達有關。

【關鍵詞】

七氟醚；心肌；心肌再灌注損傷；凋亡

Effected of sevoflurane pretreatment on myocardial Bcl-2 and Bax gene expression during ischemia/reperfusion in rats

CHEN Gen-yin,WANG Xu-guang,YANG Zhan，et al.Department of Anesthesiology，First Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang，Guangdong 524001，China

【Abstract】 Objective To investigate the effects ofpretreatment with sevoflurane on myocardial Bcl-2 and Bax gene expression during ischemia-reperfusion in rats.Methods 24 SD rats were randomly divided into 3 groups with 8 animals in each group:sham operation group(group C); ischemia-reperfusion group(group IR)，sevoflurane group(group S).In group IR animals were subjected to 3 h of ischemia by 3 h reperfusion.In group S animals inhales 2%sevoflurane for 30 min followed by 15 min of wash-out before IR.In group C animals underwent no I/R.Myocardium was obtained from marginal zone of ischemic area.The mRNA and protein expression of Bcl-2 and Bax gene were detemined by RT-PCR and western-blot.Results The expression of mRNA and protein expression of Bcl-2 were upregulated in group S and group IR compared with that in group C.The expression of mRNA and protein expression of Bax were down-regulated in group S and group IR.The expression of Bcl-2 gene in group S was higher than tha t in group IR While the expression of Bax gene was lower.Conclusion Sevoflurane pretreatment inhibits myocyte apoptosis inIR myocardiumpartly by modulation of expression of Bcl-2 and Bax genes.

【Key words】Sevoflurane；Myocardial；Myocardial reperfusion injury；Apoptosis

研究已表明吸入性麻醉藥預處理能模擬缺血預處理效應減輕缺血再灌注所致的心肌損傷［1-3］，但這種心肌損傷保護機制至今尚未完全清楚，有研究證明這與減少缺血再灌注過程中心肌細胞凋亡的發生有關［4］，但其抑制細胞凋亡的機制至今不甚明確。本研究觀察七氟醚預處理對大鼠心臟缺血再灌注過程中心肌細胞Bcl-2及Bax 基因表達的影響，探討其心肌保護作用機制與凋亡調控基因的關系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、DMSO、DEPC(Sigma公司)；Trizol(Invitrogen公司)；RT-PCR 一步法試劑盒(寶生物(大連)工程有限公司)；GAPDH、Bcl-2、Bax引物(上海生工生物工程技術服務有限公司合成)；100 bp DNA marker、TEMED、6×上樣緩沖液(華美生物工程公司)；ECL試劑、Aprotinin(上海華舜生物工程有限公司)；β-actin大鼠多抗IgG、Bcl-2大鼠單抗IgG、Bax大鼠單抗IgG、辣根酶標記山羊抗大鼠IgG(Santa Cruz公司)； PVDF膜 (美國Pall Gelman公司)。

1.2 實驗分組 健康成年SD大鼠(250~300 g) 24只，雌雄不限，隨機分成假手術對照組(C組)、缺血再灌注組(IR組)、七氟醚預處理組(S組)，每組8只。C組不進行缺血再灌注處理。IR組阻斷冠脈3 h，隨后再灌注3 h。七氟醚預處理組用麻醉機吸入2%七氟醚30 min后，洗脫15 min，然后阻斷冠狀動脈3 h，再灌注3 h。其余步驟同對照組。吸入麻醉藥組在吸入麻醉藥期間停用靜脈麻醉藥，以維持麻醉水平相對穩定。以上各組動物實驗完畢后，從心底部剪取各組動物心臟，切下心室，用于總RNA和蛋白提取。

1.3 模型制備 大鼠肌內注射氯胺酮70 mg/kg。頸部正中分離氣管并切開插管，動物呼吸機進100%純氧機械通氣，控制呼氣末CO₂分壓在4~4.5 kPa之間。分離頸外靜脈置管，持續滴注乳酸林格氏液20 ml/(kg?h)，必要時加少量碳酸氫鈉以維持血液pH值在7.35~7.45之間。麻醉維持用微量泵泵注咪唑安定0.05~0.1 mg/(kg?h)，氯胺酮2~5 mg/(kg?h)和維庫溴胺0.05~0.1 mg/(kg?h)。分離頸動脈，置管連接換能器測壓。正中劈開胸骨，切開心臟，縫線繞過左冠狀動脈前降支近端深面并膠管將其套住。拉緊套管即阻斷冠狀動脈，表現為心肌局部青紫，心電圖ST段上升。放松套管，局部反應性充血，表明心肌再灌注。如果發生室顫，用食指輕叩右室壁除顫。

1.4 觀察指標及測定方法

1.4.1 RT-PCR測心肌Bcl-2和Bax mRNA表達

將大鼠心臟剪碎，加液氮研磨，用Trizol試劑提取心肌總RNA，按一步法試劑盒步驟進行RT-PCR。Bcl-2引物為：上游5'-GCTACGAGTGGGATACTGGAG-3'，下游5'-GACAGCCAGGAGAAATCAAAC-3'，產物長度為559bp，反應條件為：50℃逆轉錄30 min；94℃預變性2 min；94℃變性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸45 s，擴增30個循環；72℃延伸10 min。 Bax引物為：上游5'-CATCCAGGATCGAGCAGAGAG-3'，下游5'-AGCAAAGTAGAAGAGGGCAACC-3'，產物長度為262 bp，反應條件為：50℃逆轉錄30 min；94℃預變性2 min；94℃變性30 s，52℃退火50 s，72℃延伸45 s，擴增30個循環；72℃延伸10 min。 退火溫度52℃；內參照GAPDH上游引物： 5'-CCTTCATTGACCTCAACTACATGG-3'，下游引物:5'-GCAGTGATGGCATDDAC TGTGGT-3'，擴增片段長度442 bp，反應條件為：50℃逆轉錄30 min；94℃預變性2 min；94℃變性40 s，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，擴增30個循環；72℃延伸10 min。PCR產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，GDS 800凝膠成像分析系統觀察結果并拍照，同時進行光密度分析。以Bcl-2或Bax PCR產物與內參照β-actin PCR產物的光密度之比作為Bcl-2或Bax mRNA的相對含量值。

1.4.2 免疫印跡法測心肌Bcl-2和Bax 蛋白表達 參考文獻方法提取心肌蛋白［5］。取50 μg蛋白質樣品加上樣緩沖液煮沸變性后，進行10%SDS PAGE；電轉移至PVDF膜；用含5%脫脂奶粉的TBS(pH 8.0)封閉2 h；分別加入適量Bcl-2大鼠單抗IgG (1:400)或Bax大鼠單抗IgG(1:400)或β-actin山羊IgG多克隆抗體(1:400)，搖床上室溫反應2 h；洗膜3次，每次20 min；加辣根過氧化物酶標記的二抗(1:6000)，室溫反應2 h；洗膜后作ECL化學發光，X片曝光顯影。結果用GDS 800凝膠圖像系統進行掃描分析，記錄平均灰度值。計算目的蛋白與內參照β-actin蛋白表達量的光密度積分值之比作為目的蛋白表達量的相對含量值。

1.5 統計學方法

計量資料表示為(x±s)，采用SPSS11.0統計軟件進行分析，行單因素方差分析。P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心肌組織Bcl-2和Bax mRNA表達情況

RT-PCR結果顯示(圖1)及圖像分析結果顯示(表1)，與C組相比較，IR組和S組Bcl-2 的mRNA表達均下調，S組高于IR組；而Bax的mRNA表達IR及S組均高于C組，IR組高于S組。

2.2 各組大鼠心肌組織Bcl-2和Bax 蛋白表達情況結果表明(圖2，表1)，Bcl-2基因的蛋白表達量IR及S組均較C組下降，S組高于IR組。Bax基因的蛋白表達量IR及S組均高于C組，IR組高于S組。

3 討論

目前認為吸入性麻醉藥的心肌保護作用機制有多因素參與，細胞凋亡機制是其中一個重要因素。研究表明，在動物缺血模型中，缺血再灌注引起的心肌損傷都有細胞凋亡的參與。近年來動物實驗觀察到吸入性麻醉藥對IR心肌細胞凋亡有抑制作用，與缺血預處理相似的保護效應［6］。但其抑制細胞凋亡的機制至今不甚明確，尤其對細胞凋亡的基因調控有何影響，還需進一步研究。

心肌細胞凋亡的調節基因主要有C-Myc、p53及Bcl-2家族。其中Bcl-2基因家族是一類結構相似包含兩類功能相反的基因，一類是抑制細胞凋亡的基因如Bcl-2、Bcl-XL和Al等，另一類是促進細胞凋亡的基因如Bax、Bak、Bok、Bcl-Xs等。Bcl-2可通過抑制自由基的產生及細胞內鈣超載，抑制線粒體膜的通透性，阻止細胞色素C的釋放及抑制線粒體凋亡誘導因子等機制發揮抑制細胞凋亡的作用。Bcl-2過表達時能完全抑制脂質過氧化，從而對IR心肌具有強大的抗細胞凋亡作用［7］。Bax的作用正與Bcl-2蛋白相反，促進細胞凋亡［8-9］。Bcl-2和Bax兩者的比例決定細胞是生存還是凋亡，當Bcl-2增多時形成Bcl-2同源二聚體，細胞受到保護；當Bax增多時形成Bax/Bcl-2異源二聚體，細胞趨向凋亡。I/R心肌細胞凋亡的確切機制目前還未十分明確，目前認為，IR所致的心肌細胞內鈣超載，產生的大量氧自由基及多形核中性粒細胞的積聚是IR期間心肌細胞凋亡的誘因，通過不同的信號轉導通路，啟動內部機制，影響基因表達的水平，破壞凋亡誘導基因和凋亡抑制基因之間的動態平衡，導致細胞凋亡。許多研究結果證明了吸入性麻醉藥對心肌缺血再灌注的保護作用與調節細胞凋亡有關，但其與凋亡相關基因Bcl-2、Bax表達之間的關系還不是很清楚。本實驗結果發現，在七氟醚組Bcl-2表達明顯強于IR組，而Bax表達則明顯低于IR組，說明七氟醚預處理對缺血再灌注心肌能夠上調Bcl-2基因的表達、下調Bax基因的表達。結果表明七氟醚對心肌保護作用，其中一個機制可能是通過調控凋亡相關的Bcl-2和Bax的表達來實現。

七氟醚預處理可調節Bcl-2及Bax基因的表達，但它對其他凋亡相關基因是否也有作用，以及相關的機制是什么，這還需要更全面、更深入的研究。

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