祛瘀化痰法對哮喘大鼠血管內皮細胞黏附分子及白介素１２表達的影響

賀　明　楊建民　張　靜

【摘要】 目的 研究蠲哮湯對哮喘大鼠血管內皮細胞黏附分子（ICAM-1）及白介素12（IL-12）表達的影響。方法 建立由卵蛋白誘發的支氣管哮喘大鼠模型；采用ELISA法檢測哮喘大鼠靜脈血和肺泡灌洗液(BALF)中ICAM-1、IL-12的含量。結果 模型組ICAM-1高表達，IL-12低表達，蠲哮湯能減少造模動物ICAM-1的表達，提高IL-12的表達。結論 蠲哮湯能減少造模動物ICAM-1，提高IL-12的表達，而且隨著藥物劑量的減少，各分表達呈遞增趨勢，具有量效關系。

【關鍵詞】蠲哮湯；哮喘大鼠動物；祛瘀化痰法；ICAM-1；IL-12

Effects of Juanxiao decoctionon expression of ICAM-1 and IL-12 in asthmatic rats

HE Ming，YANG Jian-min，ZHANG Jing.Guangdong Xinhai Hospital，Guangzhou 510300,China

【Abstract】 Objective To explore effects of Juanxiao decoction on expression of ICAM-1 and IL-12 in asthmatic rats.Methods Ovalbumin-inducedasthmatic rat modelwas established ; venous blood and Bronchoalveolar Lavage Fluid were collected from asthmatic rats to measure the levels ofICAM-1 and IL-12 with ELISA.Results Higher expression of ICAM-1 and lower expression of IL-12 were found in model group.Conclusion Juanxiao decoctiondecreased expression of ICAM-1 and increased expression of IL-12 in model rats，anddose-effect relationship between the Juanxiao decoction and model rats was showed.

【Key words】Juanxiao decoction; Asthmatic rat model; Removing blood stasis and dissipating phlegm; ICAM-1; IL-12

支氣管哮喘是一種以嗜酸性細胞反應為主的慢性氣道炎性反應，嗜酸性細胞等分泌TXA2、PGI2等炎性介質可引起支氣管平滑肌收縮、微血管擴張、通透性增高和滲出物增多等一系列的炎性反應。目前認為，白細胞和內皮細胞表面的細胞黏附分子特別是ICAM-1等的相互作用是炎性反應形成的基礎。細胞因子誘發黏附分子表達則對氣道炎性反應的形成起決定作用，而在哮喘中IL-12缺陷導致IL-4等TH-2類細胞因子增多，誘發黏附分子表達增強而產生炎性反應。研究表明，提高IL-12水平或阻斷ICAM-1的激活可以減少炎性介質的釋放，減輕氣道炎性反應。臨床實踐表明袪血化瘀法(如蠲哮湯)治療哮喘有滿意的療效，且能改善微循環、減少TXA2等炎性介質的釋放，故推測袪血化瘀方蠲哮湯可能通過提高IL-12水平、阻斷ICAM-1的激活或使其處于低表達水平，抑制炎性介質的釋放，從而達到治療哮喘的目的。本文以臨床經驗為基礎，研究蠲哮湯對哮喘大鼠血管ICAM-1及IL-12表達的影響，從子生物學水平探討祛痰化瘀法治療哮喘的作用機理，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級SD大鼠48只，體質量200~250 g，雄性，由中山醫科大學動物實驗中心提供(實驗動物合格證號：醫動字第26-98A001)，隨機分為6組，包括正常對照組、哮喘模型組、蠲哮湯大、中、小劑量組、陽性藥對照組各8只。

1.1.2 實驗藥物 蠲哮湯組成：葶藶子10 g、青皮10 g、陳皮10 g、檳榔10 g、大黃10 g、生姜10 g、牡荊子15 g、鬼箭羽15 g。中藥飲片購自廣州中醫藥大學第一附屬醫院，均為合格藥材，將各個組成成分均研細末過100目篩，然后按比例混合，加蒸餾水煎汁濃縮到0.5 g生藥/ml備用。

1.1.3 試劑 Elisa試劑盒IL-12，ELISA試劑盒由深圳晶美生物工程有限公司提供。卵白蛋白(OVA)為Sigma公司產品。

1.1.4 主要儀器 PE480熱循環儀，高速冷凍離心機(SORVALLRC5C Plus)，UV1601型紫外分光光度儀(SHIMADZU)，ZF型紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)，凝膠圖像分析儀(SYNGENE)。

1.2 方法

1.2.1 造模及各組干預措施 參照文獻方法造模［1，2］，先以10%卵蛋白生理鹽水1 ml腹腔注射，2周后將致敏大鼠放入半密閉的有機玻璃罩內，以50 kPa(1 kPa=7.5 mm Hg)恒壓噴入2%卵蛋白生理鹽水20 s后再在霧室中放置30 s；隔日誘喘1次共5次；以大鼠腹肌明顯收縮為陽性。①正常對照組：用0.9%生理鹽水1 ml腹腔注射，2周后用同樣的方法霧化吸入0.9%生理鹽水。分別于第3、4、5次霧化吸入0.9%生理鹽水誘喘后胃內注入蒸餾水3 ml；②哮喘模型組：按上法制備哮喘動物模型，于第3、4、5次誘喘后胃內注入蒸餾水3 ml；③蠲哮湯大、中、小劑量組藥物組：按上法制備哮喘動物模型，分別于第3、4、5次誘喘后胃內注入(灌胃)已煎好的中藥3 ml(用藥量相當于成人每千克用藥量的3倍)；④陽性藥對照組：按上法制備哮喘動物模型，分別于第3、4、5次誘喘后胃內注入。

1.2.2 標本采集及處理 ①末次給藥后禁食12 h，在各組動物的胃內分別灌入相應的藥物或生理鹽水，40 min后以0.4%的戊巴比妥鈉麻醉動物，剖腹抽取腹腔靜脈血5 ml，4℃、3000轉/min離心5~10 min，取上清液-20℃保存待檢ICAM-1、IL-12。②10 ml生理鹽水注入各組大鼠支氣管肺組織內反復抽吸3次，將抽吸的BALF放入離心管中1000轉/min離心5~10 min，取上清液-20℃保存待檢ICAM-1、IL-12。按照試劑盒說明書檢測血清及支氣管肺泡灌洗液中ICAM-1、IL-12。

1．3 統計學方法 計量資料均以均數±標準差（x±s）表示，各組數據均用t檢驗。采用SPSS 10.0統計軟件進行分析，以P為差異有統計學意義。

2 結果

蠲哮湯可以減少細胞黏附因子(ICAM-1)的表達，蠲哮湯藥物組與正常對照組、哮喘模型組和陽性藥物對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。其中蠲哮湯高中低劑量組之間減低ICAM-1表達之間也存在差異，隨著劑量減低，減少ICAM-1表達的效果減低。見表1。

蠲哮湯可以增加血清及肺泡灌洗液中IL-12的表達，蠲哮湯藥物組與正常對照組、哮喘模型組和陽性藥物對照顯著增加(P<0.05)。

注：與正常組、哮喘模型組、陽性藥物對照組比較,#P<0.05；與正常對照組比較,*P<0.05

3 討論

哮喘的氣道炎性反應主要涉及嗜酸粒細胞、肥大細胞和淋巴細胞。這些炎性細胞可以合成和釋放多種炎性介質并在哮喘的發病中發揮重要作用。目前認為，白細胞和內皮細胞表面的細胞黏附分子(cell adhesion molecules，CAM)的相互作用是炎性反應形成的基礎。因此CAM在哮喘氣道炎性反應的發生中起重要作用，且日益受到重視［4］。CAM是位于細胞膜表面的一類大分子糖蛋白，根據其結構不同可分為三類：免疫球蛋白超家族如ICAM-1、VCAM-1等，整合素超家族(VLA-4等)，選擇素超家族(E-選擇素等)。主要作用是介導細胞與細胞間、細胞與細胞外基質相互粘連，從而促使白細胞附壁、外滲、游走、聚集、抗原表達和淋巴細胞激活。因此對白細胞在哮喘氣道炎性反應時的組織浸潤、炎性介質的釋放等起重要作用。

IL-12在哮喘發病中的作用尤為重要。因為IL-12不僅誘導多種細胞因子的產生，而且可以調節TH-1/TH-2細胞免疫應答的平衡來調節機體的免疫功能。實驗表明IL-4可誘導TH-2類免疫應答導致氣道高反應和嗜酸球增多，IL-12則能抑制TH-2免疫應答而增加TH-1免疫應答，抑制哮喘的氣道高反應和炎癥細胞浸潤［5］。Nasser等觀察到過敏性哮喘患者氣道活檢組織中IL-12 mRNA的表達較正常人顯著降低。以上結果表明在哮喘發病中IL-12的缺陷使TH-2細胞免疫應答增強(如IL-4等增多)、TH-1細胞免疫應答減弱，結果ICAM-1表達增強，炎性反應介質釋放增多。

蠲哮湯方中葶藶子、青皮、陳皮、檳榔、牡荊子瀉肺除壅，俾氣順則痰降，氣行則痰消；肺與大腸相表里，哮證病作，多因肺氣壅滯而致腑氣不通，以致濁氣不降而上逆，又加重肺氣壅滯，而使哮喘難以緩解，故方中伍大黃以通肺氣，腑氣通則肺氣自降；鬼箭羽活血化瘀，且有抗過敏作用，與逐瘀除壅之大黃相配，更能增強化瘀之功。哮證發作，常為外感誘發，伍生姜既可外散表寒，又可內散水飲，且能防葶藶子、大黃苦寒傷胃之弊。全方合用，共奏瀉肺除壅，祛痰化瘀，利氣平喘之功。且臨床顯示蠲哮湯可以較好的減少哮喘患者發作的頻率及減輕發作時的癥狀等。

本實驗結果顯示蠲哮湯可以提高IL-12的表達，減少ICAM-1的表達，起到了控制氣道炎癥及減輕氣道高反應的作用，為臨床應用提供了理論基礎。

參考文獻

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