阿托伐他汀干預對大鼠心肌缺血再灌注后GRP78和GADD153表達的影響

【摘要】 目的 觀察阿托伐他汀干預對大鼠心肌缺血再灌注損傷后內質網分子伴侶GRP78(endoplasmic reticulummolecular chaperon)和GADD153 (growth arrest and DNA damageinducible gene 153)表達變化的影響，探討阿托伐他汀在心肌缺血再灌注損傷后抗凋亡的內質網應激機制。

方法將54只SD大鼠隨機分為阿托伐他汀干預組24只、模型對照組24只和假手術組6只，制作大鼠心肌再灌注損傷模型。阿托伐他汀干預組和模型對照組再灌注2 h、6 h、24 h、48 h分別分為4個亞組，每個亞組動物6只。通過TUNEL檢測心肌細胞凋亡，免疫組織化學檢測GRP78和GADD153表達變化。結果 假手術組大鼠偶可見凋亡細胞，對照組和干預組大鼠缺血再灌注2 h缺血周圍區可見少量凋亡細胞，再灌注6 h凋亡細胞有所增多，再灌注24 h凋亡細胞數量達高峰，再灌注48 h凋亡細胞有所減少(P<0.05或0.01)。相同各時間點比較，干預組大鼠心肌細胞凋亡顯著少于對照組(P<0.05或0.01)。假手術組大鼠心尖部相應區域心肌細胞未見明顯GRP78 及GADD153陽性表達。對照組和干預組大鼠再灌注2 h后心尖部GRP78表達開始增加，6 h達高峰，24 h時表達水平明顯下降(P<0.01)。在相應時間點，干預組的GRP78蛋白表達水平顯著高于對照組(P<0.01)。對照組和干預組大鼠缺血周圍區GADD153從再灌注6 h開始在神經細胞內明顯表達，并逐漸增強，于再灌注24～48 h達高峰(P<0.01)。在相應時間點，干預組的GADD153蛋白表達水平顯著低于對照組(P<0.01)。結論干預心肌缺血再灌注后心肌細胞內質網伴侶GRP78和GADD153的表達可能是阿托伐他汀抑制心肌缺血再灌注損傷后抗凋亡的內質網應激機制之一。

【關鍵詞】 阿托伐他汀;GRP78;GADD153;細胞凋亡;缺血再灌注損傷

文章編號:1003-1383(2010)05-0517-04 中圖分類號:R 541.4 文獻標識碼:A

doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2010.05.001

早期溶栓和急診冠狀動脈介入(急診PCI)是治療急性心肌梗死(AMI)最有效方法，能使梗死相關血管再通，缺血心肌得到再灌注，縮小梗死面積，改善預后。然而，心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)后常常出現的損傷影響了再灌注的療效。已有研究證實，心肌缺血再灌注時誘導的細胞凋亡是急性心肌I/R損傷的主要形式[1]。內質網應激(ER stress，ERS)啟動的途徑是近年發現的一種新的凋亡途徑，Nickson等[2]研究發現ERS參與I/R心肌損傷的病理過程。阿托伐他汀是羥甲基戊二酰輔酶A(hydroxymethylglutaryl coenzyme a reductase inhibitor，HMGCoA)還原酶選擇性抑制劑，為高效廣譜他汀類降脂藥物。阿托伐他汀用于心肌梗死治療的機制除了與調脂作用有關外，還與抑制細胞凋亡等相關[3]，其抑制心肌缺血再灌注后細胞凋亡具體機制目前尚未完全闡明。本研究通過觀察阿托伐他汀干預對內質網分子伴侶GRP78和GADD153[4]的表達影響，探討其抑制缺血再灌注后細胞凋亡的內質網應激機制。

材料與方法

1.動物及分組 健康清潔級雄性SD大鼠54只，體重280～330 g，購自廣西醫科大學動物實驗中心(許可證號:SCXK桂20030003)，隨機分為干預組24只，給予阿托伐他汀(商品名立普妥，輝瑞制藥公司)灌喂20 mg#8226;kg-1#8226;d-1干預，對照組24只，給予0.9%氯化鈉溶液灌喂2 ml/d，假手術組6只給予0.9%氯化鈉溶液灌喂2 ml/d。三組灌喂3 d后制作大鼠心肌I/R模型。阿托伐他汀干預組和模型對照組再灌注2 h、6 h、24 h、48 h分別分為4個亞組，每個亞組動物6只。

2.大鼠心肌缺血再灌注模型的制作 參照Bimbaum法[5]制作缺血再灌注模型，即大鼠以水合氯醛(35 mg/100g體重)腹腔注射麻醉，觀察呼吸及反應，穩定后固定于手術臺。接心電圖機，實驗過程中動態觀察并記錄Ⅱ導聯心電圖，保持大鼠自然呼吸狀態。氣管插管，接人工呼吸機(頻率55次/min潮氣量115 ml/100 g)后。開胸，于冠狀動脈左前降支起始0.2 cm處穿線，待呼吸、血壓平穩15 min后，用一硅膠管墊于血管和結扎線之間結扎，假手術組僅穿線不結扎。30 min后剪開結扎線。制模成功的標志:結扎線遠端心肌顏色紫紺，心電圖表現為R波高聳或ST段抬高，松開結扎線后缺血部位心肌顏色恢復，抬高的ST段下降。

3.TUNEL法檢測心肌細胞凋亡 采用TUNEL(試劑盒購于博士德公司)法進行檢測。各組(亞組)大鼠再灌注后相應時間點麻醉、開胸，取左室前壁中間段梗死區邊緣心肌組織0.5 cm×0.1 cm×0.1 cm，10%甲醛室溫固定，常規石蠟包埋、切片、脫蠟至水后，專人嚴格按TUNEL試劑盒說明書操作。中型樹膠封片，顯微鏡下觀察;在400倍鏡下，計算10個不重疊視野TUNEL陽性細胞比例的平均值，并以百分數(%)表示凋亡指數(Apoptotic Index，AI)。

4.免疫組化檢測GADD153和GRP78蛋白表達 各組(亞組)大鼠再灌注后相應時間點麻醉、開胸，取心尖部約0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm，10%甲醛室溫固定，常規石蠟包埋切片。采用SABC法檢測GRP78和GADD153蛋白表達，按試劑說明操作。具體是:石蠟切片常規脫蠟至水，0.3%H2O2室溫孵育10 min封閉內源性過氧化物酶，蒸餾水洗三次，將切片浸入0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)，微波爐中加熱至沸騰后斷電，間隔5 min后反復1次，室溫自然冷卻，PBS(pH 7.2～7.6)洗兩次。滴加5%BSA封閉液，室溫留置?20 min，甩去多余液體，不洗。滴加稀釋1∶100的一抗(GRP78羊抗多克隆抗體、GADD153兔抗多克隆抗體購自Santa Cruz公司)，4℃過夜，PBS(pH 7.2～7.6)洗2 min×3次。滴加生物素化二抗，37℃反應20 min，PBS(PH 7.2～7.6)洗2 min×3次。滴加試劑SABC(武漢博士德生物公司)，37℃孵育20 min，PBS(pH 7.2～7.6)洗5 min×4次。陰性對照組以PBS代替。DAB顯色:取1 ml蒸餾水，分別加入DAB顯色試劑盒中A、B、C試劑各一滴，混勻后加至標本片上，鏡下控制顯色時間，在5～15 min之間，水洗。

5.病理圖像分析 采用CMIAS2001 B病理圖像采集分析系統定量分析陽性細胞平均光密度值。

6.統計學處理 采用SPSS 15.0統計軟件對實驗數據進行分析，計量資料以均數±標準差(-±s)表示，組內不同時間點比較采用配對均數t檢驗，組間相同時間點比較采用兩獨立樣本均數t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

結果

1.細胞凋亡的TUNEL檢測 假手術組大鼠偶可見凋亡細胞，推測系生理性死亡的心肌細胞。對照組和干預組大鼠缺血再灌注2 h缺血周圍區可見少量凋亡細胞，再灌注6 h凋亡細胞有所增多，再灌注24 h凋亡細胞數量達高峰，細胞核呈棕褐色著染，濃縮，致密，核形不規則，大小不一(見圖1)，再灌注48 h凋亡細胞有所減少(P<0.05或0.01)。相同各時間點比較，干預組大鼠心肌細胞凋亡顯著少于對照組(P<0.05或0.01)。見表1。

2.GRP78和GADD153的蛋白表達

(1)GRP78的蛋白表達情況假手術組大鼠心尖部相應區域心肌細胞未見明顯GRP78陽性表達。對照組和干預組大鼠再灌注2 h后心尖部GRP78表達開始增加，6 h達高峰(P<0.01)，GRP78陽性染色細胞呈棕黃色，主要位于胞漿，細胞形態相對飽滿，呈圓形或橢圓形(見圖2)，24 h時表達水平明顯下降(P<0.01)。在相應時間點，干預組的GRP78蛋白表達水平顯著高于對照組(P<0.01)。見表2。

(2)GADD153的蛋白表達情況 假手術組大鼠心尖部相應區域心肌細胞未見明顯GADD153陽性表達。對照組和干預組大鼠缺血周圍區GADD153從再灌注6 h開始在神經細胞內明顯表達，并逐漸增強，于再灌注24～48 h達高峰，GADD153陽性表達主要位于細胞核，呈棕黃色，胞漿可有淡染，多數陽性細胞發生形態學改變，胞核皺縮，呈梭形或條索狀(見圖3)。在相應時間點，干預組的GADD153的蛋白表達水平顯著低于對照組(P<0.01)。見表3。

討論

內質網是細胞內調控鈣穩態、蛋白質合成和細胞凋亡的重要亞細胞器，對應激刺激非常敏感[6]。內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)近年來備受關注，ERS與神經退行性變、糖尿病和心腦組織缺血梗死密切相關[7]。適度的ERS有利于細胞內鈣和蛋白質加工等穩態恢復正常，增強細胞耐受應激刺激的能力;持續而嚴重的ERS則觸發內質網相關性細胞凋亡(ER associated death，ERAD)，造成細胞損傷，ERAD途徑主要包括capase12剪切活化、CHOP/GADD153(C/EBP homologous protein/gene forgrowth arrest and DNA damage)表達上調，以及cjun氨基末端激酶(cJun NH2 terminal kinases，JNK)途徑的激活[8]。越來越多的動物模型和人體標本的證據，證實凋亡在心肌缺血再灌注損傷病理生理學上是一個主要事件。分子伴侶GADD153是內質網相關促凋亡蛋白，在正常細胞中表達水平很低，而在內質網應激情況下被大量誘導表達，激活細胞凋亡途徑。內質網分子伴侶GRP78(endoplasmic reticulummolecular chaperon GRP78)又稱為Bip，其位于內質網，是內質網穩態的中心調節劑[9]，內質網應激時，GRP78與內質網中錯誤折疊和未折疊蛋白結合，恢復蛋白質正確構象，維持內環境穩定，提示GRP78在應激條件下對細胞起保護作用。

近年來隨著對他汀類藥物的深入研究，其非降脂作用受到極大關注。研究發現他汀類藥物非降脂外效應與逆轉心肌肥大，抑制心肌凋亡等有關[10]。本實驗研究發現，阿托伐他汀可以抑制心肌缺血再灌注后的心肌細胞調亡，與孟紅、Yang等[3，11]研究結果一致。通過對內質網應激途徑的經典標志物GRP78和GADD153的蛋白檢測，我們發現阿托伐他汀促進心肌缺血再灌注后GRP78蛋白表達，同時觀察到GRP78陽性染色細胞形態相對飽滿，提示阿托伐他汀可能通過上調GRP78蛋白表達水平對內質網應激反應啟動后迅速發揮內質網自穩功能，細胞適應應激而存活。與此同時，阿托伐他汀抑制心肌缺血再灌注稍后期GADD153表達，多數GADD153陽性細胞形態學發生改變，胞核皺縮，呈梭形或條索狀，提示阿托伐他汀對心肌缺血再灌注稍后期保護可能與下調GADD153表達水平有關。由于內質網應激途徑比較復雜，阿托伐他汀還可能通過內質網應激其他途徑，如PI3K/Akt/eNOS[12]途徑等。

綜上所述，我們認為，通過促進內質網分子伴侶GRP78的表達和下調GADD153水平，可能是阿托伐他汀抑制心肌再灌注后心肌細胞凋亡的內質網應激機制之一。

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(收稿日期:2010-06-04 修回日期:2010-09-08)

(編輯:梁明佩 英文審校:唐雄林)