銅綠假單胞菌適配體的獲得及應用

劉星雨 李潔 朱龍佼 李相陽 許文濤

（1. 中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2. 北京農學院食品科學與工程學院, 北京 102206；3. 中國農業大學營養與健康系，北京 100083）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種適應性和多樣性極高的微生物，能夠定植廣泛的生態位，是引起人類機會性感染最主要的條件致病菌［1-2］。銅綠假單胞菌是囊性纖維化、慢性阻塞性肺病、支氣管擴張等基礎呼吸道病患病情加速加重的主要因素，可引起術后創口感染、燒傷創面感染，菌體通過血液散播并產生毒素，引發菌血癥、敗血癥而造成死亡，目前已經成為重癥監護病房感染的第二大致死病原菌［3-5］。銅綠假單胞菌的致病性主要是由于其大量的毒力因子和抗生素耐藥性造成的，其毒力因子主要包括脂多糖、外膜蛋白、多種分泌物等。作為常見的致病菌，銅綠假單胞菌即使是在低濃度下也會引起嚴重的感染，其生物膜的形成和外膜的低滲透性，使其對抗生素和抗菌劑具有良好的抗性［6］。作為一種具有強抗藥性的條件致病菌，銅綠假單胞菌在2017年被列為世界衛生組織抗藥性細菌名單中的第二大威脅，并進入高優先級病原體名單，而感染的患者本身抵抗力低下，用藥情況復雜，使得抗菌藥物的選擇更加局限，一旦感染，臨床治療十分困難。鑒于其嚴重的危害，針對銅綠假單胞菌的疫苗已經進行了50多年的研究，但仍然缺少可用的產品［7］。因此早期檢測診斷在銅綠假單胞的防治中十分重要，這就需要快速、高效、高特異性地對其進行檢測，并且持續不斷的對其感染后的治療進行研究。適配體作為一種新型的靶向識別元件，在銅綠假單胞菌的檢測和防治方面得到了許多研究者的關注。

適配體是通過指數富集的配體系統進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX）得到的具有特異性識別能力的人工合成寡核苷酸序列，1990年首次通過體外篩選被開發［8］。適配體一般為幾十個堿基構成的DNA或者RNA序列，目前已經有超過千項的適配體篩選研究被報道［9］。適配體的可識別靶標十分豐富，包括重金屬、細胞、蛋白質等多種物質［10］。由于其具有高親和力、高特異性且易于合成和修飾等特點，得到了廣泛的研究。

本文總結了目前銅綠假單胞菌適配體的篩選和裁剪，并從銅綠假單胞菌的檢測和防治兩個方面對其適配體的應用進行了介紹，以期為銅綠假單胞菌適配體的開發和應用提供參考。

1 銅綠假單胞菌的篩選和裁剪

高性能適配體的獲得是實現多領域應用的基礎，為了獲得更好的適配體，往往需要進行篩選和裁剪。在適配體的篩選中，首先對寡核苷酸文庫進行制備，并將含有隨機寡核苷酸數量超過1014以上的RNA或者DNA文庫與靶標物質進行孵育，經過一定時間的反應后，將可以與靶標結合的核酸序列與未結合的核酸序列進行分離，對于可結合靶標的核酸，通過PCR等方式對其進行擴增，以生成新的寡核苷酸庫。重復以上步驟5-15次后對富集文庫進行測序，并通過多種技術對測序得到的序列進行親和力和特異性分析，最終從數量龐大的文庫中得到具有優越性能的適配體序列用于下一步的傳感器開發（圖1）［11-13］。盡管通過幾輪甚至十幾輪的篩選，可以從中獲得較好的核酸序列，但是由于隨機文庫篩選中固有的局限性，即使隨機文庫中已經具有相當多數量的核酸序列，篩選獲得適配體序列依然可能存在部分堿基在特異性的識別中不能發揮積極的作用，因此通過裁剪對這些冗余的堿基進行去除或對有效堿基進行重復有助于獲得性能更優的適配體。目前，針對銅綠假單胞菌已有多種適配體得到了開發和應用，除了以微生物適配體篩選中常見的全細胞作為篩選靶標外，銅綠假單胞菌的外毒素A和脂多糖也被用作靶標進行相關適配體的篩選（表1），多種銅綠假單胞菌靶標適配體的篩選為其檢測提供了更加廣泛的可能性。此外，在已經篩選的銅綠假單胞菌適配體中，既包括DNA適配體，也包括RNA適配體。

表1 銅綠假單胞菌適配體的篩選Table 1 SELEX of Pseudomonas aeruginosa aptamers

圖1 SELEX 流程圖Fig. 1 Flowchart diagram of SELEX

全菌是微生物適配體篩選中最常見的靶標，利用菌體較大的特點，通過離心操作可以有效的分離結合序列和未結合序列，在銅綠假單胞菌的適配體篩選中，既包括了以死菌為靶標的適配體篩選，也包括了以活菌作為靶標的篩選。2011年，Wang等［14］首次對銅綠假單胞菌的適配體進行了篩選，經過15輪的篩選，文庫通過流式細胞術測定的結合能力不再繼續增加，因此結束篩選進行核酸測序，經過測序得到了親和力為（17.27 ± 5.00）nmol/L的適配體序列。2017年，Soundy等［15］首次針對活的銅綠假單胞菌開展了適配體的篩選。經過7輪的全細胞篩選，對熒光標記的適配體進行流式細胞術分析，第7輪文庫與靶標的結合效果與初始文庫相比有了顯著的增強，經過測序得到了適配體序列JN08和JN27，經過二級結構預測，JN27中單個莖環為唯一顯著的穩定結構。因此對該莖環部分單獨進行序列合成，并通過流式細胞術進行結合效果的評估，結果驗證具有莖環結構的適配體序列具有較好的結合效果，是篩選得到的長適配體序列的核心結合區域。

除了對全菌進行篩選，銅綠假單胞菌的毒力因子也已經作為靶標物質開展了適配體的篩選。外毒素A是銅綠假單胞菌重要的毒力因子，也是其感染的重要標志物。Hong等［16］利用誘餌SELEX（Decoy-SELEX）對外毒素A的適配體進行篩選。在篩選中牛血清白蛋白和霍亂毒素作為負篩靶標使用，經過14輪的篩選對測序得到的適配體序列，利用表面等離子共振進行親和力的檢測，得到Kd值為4.2-4.5 μmol/L。此外，Ye等［17］基于Capture-SELEX技術篩選得到了適用于包括銅綠假單胞菌在內的多種菌脂多糖檢測的適配體，其長度為80 nt，由于較長的核酸序列難以從石墨烯表面進行釋放，進一步對其進行裁剪，并利用等溫量熱滴定法對其親和力進行評估，最終確定了27 nt的最佳適配體，該適配體可以對鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌的脂多糖進行識別和結合，并且在裁剪中親和力從（102±17）nmol/L上升至（46.2±9.5）nmol/L。

除了這些DNA適配體，銅綠假單胞菌的RNA適配體也得到了開發。與DNA適配體相比，RNA適配體盡管穩定性稍差但在內化至細胞方面更具優勢。利用氟修飾的RNA文庫，Davydova等［18］篩選得到了可以內化到細菌細胞中的適配體，測序后發現，該適配體與銅綠假單胞菌rRNA片段相同，進一步佐證了該適配體可以內化至細菌細胞的可能性。

2 銅綠假單胞菌適配體的應用

作為一種具有嚴重危害的安全風險因子，如何進行快速檢測和防治十分關鍵。經過篩選和裁剪得到的適配體作為一種高親和力、高特異性的識別元件可以在檢測和治療上進行應用。目前基于適配體的銅綠假單胞菌檢測及其引起的疾病治療，引起了研究者的廣泛關注。

2.1 適配體在銅綠假單胞菌檢測中的應用

作為一種亟待檢測的致病微生物，許多用于銅綠假單胞菌檢測的方法已經得到了開發，包括傳統檢測中常見的微生物分離培養與鑒定，以聚合酶鏈式反應為主的分子生物學方法和以酶聯免疫分析為主的免疫學技術［22-23］。盡管已有的檢測方法十分多樣，但是這些方法往往受到成本、檢測時間和檢測性能不佳的制約。因此，適配體因其獨特的優勢得到了研究者的青睞。

由于可以直接地肉眼對檢測結果進行觀察，且檢測簡單快速，因此比色法是常見的生物傳感器。如圖2-A所示，Schmitz等［24］基于帶負電荷的核酸可以非特異性地與金納米顆粒進行結合，并因此阻礙其聚集變色的原理，開發了一種無需對納米顆粒進行表面改性的適配體生物傳感器，用于銅綠假單胞菌的檢測。這種比色的檢測方法簡單快速，但由于缺少信號放大和更靈敏的信號讀取，檢測限往往不足以滿足檢測的需求。因此，基于適配體和納米酶的電化學方法應運而生。電化學傳感器是以工作電極作為固定生物識別分子和電化學活性分子的平臺，靶標導致電極表面發生化學反應，而后被轉換為安培、阻抗等不同形式的電化學信號。同樣是基于核酸適配體對金納米顆粒的非特異性吸附，Das等［25］利用金納米顆粒固有的過氧化物酶活性，開發了一種超靈敏的電化學適配體傳感器，金納米顆粒催化3,3',5,5'-四甲基聯苯胺（3,3',5,5'-tetramethyl benzidine, TMB），可以產生具有電活性的產物二亞胺，進一步轉化為電信號輸出，該傳感器可以在10 min內完成對銅綠假單胞菌的檢測，檢測限約為10 CFU/mL（圖2-B）。相似地，Abedi等［26］開發了一種夾心型的電化學適配體傳感器，利用雙信號放大的策略實現了銅綠假單胞菌的高靈敏檢測。如圖2-C所示，適配體分別固定在具有銀納米粒子的二維石墨氮化碳和經過修飾的碳絲網印刷電極上，當銅綠假單胞菌存在時電極上的適配體對其進行捕獲，隨后加入具有銀納米粒子的二維石墨氮化碳，其上的適配體同樣與銅綠假單胞菌進行結合，從而形成三明治夾心結構，銀納米粒子作為一種報告信號實現電信號的增強，該傳感器可以實現1 CFU/mL的檢測限，并且可以實現活死菌的區分。Roushani等［27］以六氰亞鐵酸鹽為電化學指示劑，搭建銀納米粒子-玻碳電極傳感器，對血清樣本中的銅綠假單胞菌進行了檢測，檢測限為33 CFU/mL。

圖2 用于銅綠假單胞菌檢測的適配體傳感器Fig. 2 Aptamer sensor for P. aeruginosa detection

除了比色法和電化學方法，熒光生物傳感器也常見于各種微生物檢測中。適配體熒光傳感器是通過熒光信號標記的適配體與靶物質相互作用，引發熒光強度變化或偏振來實現檢測，適配體熒光傳感器具有操作快速、成本低、儀器簡單等優勢，是一種常用的檢測方案。Xie等［28］認為雜交鏈式反應和DNA酶的聯合使用有助于更低檢測限的實現，因此開發了一種基于雙鏈DNA分支遷移誘導的HCR和DNA酶反饋電路的熒光生物傳感器，用于銅綠假單胞菌的靈敏檢測。如圖2-D所示，當靶標存在時，雙鏈DNA分支遷移產生了兩個“Y”型的DNA結構，同時觸發了HCR和DNA酶的反應，促進信號的放大，實現了無蛋白酶和復雜擴增的檢測，檢測限為37 CFU/mL?；诠鈱W的適配體傳感器用于銅綠假單胞菌檢測的研究還有很多。Hu等［29］在金納米三角陣列表面搭建局域SPR傳感芯片，通過連接在芯片上的適配體捕獲銅綠假單胞菌，檢測限低至10 CFU/mL。Zhong等［30］構建了一種磁納米顆粒（magnetic nanoparticles, MNPs）-apt-cDNA結構，對銅綠假單胞菌進行檢測，檢測限低至1 CFU/mL，整個檢測過程可在1.5 h內完成。

目前適配體傳感器已經可以實現快速和靈敏的銅綠假單胞菌檢測，未來如何將技術整合至一體化的檢測裝置，實現更加方便快捷的應用和長期穩定的信號輸出方面還應當進行進一步的探索。

2.2 適配體在銅綠假單胞菌防治中的應用

2017年，銅綠假單胞菌的碳青霉烯類耐藥菌株被世界衛生組織認定為最具有威脅性的病原體之一，亟需新興抗生素的開發，但是由于在感染早期無法快速識別病原體，往往造成患者不能被及時治療［31］。經過篩選和裁剪得到的適配體作為一種高親和力、高特異性的識別元件，可以在檢測和治療上進行使用。

基于適配體的納米材料已經開展了多項研究［32］，其中以適配體為靶向元件，以納米材料實現抑菌作用的適配體功能化納米材料，在靶標抑菌方面也得到較多關注［33-34］。利用適配體和二硫化鉬納米片包覆的金納米棒靶向多重耐藥的銅綠假單胞菌，Lv等［35］開發了一種可以精準損傷銅綠假單胞菌的新材料，如圖3-A所示，適配體使材料具有靶向銅綠假單胞菌脂多糖的能力，納米棒則在近紅外激光下溫度提升，這種溫度的提升對細菌的細胞壁造成更加顯著的損傷，研究表明這種新材料可以對靶標產生精準的物理損傷，有效減少過量的炎性巨噬細胞，加速感染傷口的愈合。除了利用這種抑菌材料與適配體進行偶聯，利用核酸作為模板進行金屬納米簇的開發也是一種常見的靶向抑菌劑開發途徑。相似地，Kraemer等［36］制備了一種傷口敷料材料，這種材料基于膠原蛋白凝膠形成類似新鮮傷口細胞外基質的狀態，并利用適配體進行化學交聯形成銅綠假單胞菌的捕獲網絡，當靶標存在時實現抗菌肽的釋放，最終達成了對銅綠假單胞菌的靶向殺滅。Soundy等［37］開發了一種使用適配體作為銀納米簇合成支架的抗銅綠假單胞菌劑，碘化丙啶染色顯示這種抑菌劑可以在10 min內迅速殺死50%的靶標菌。

圖3 基于適配體的銅綠假單胞菌防治Fig. 3 Aptamer-based control of P. aeruginosa

除了與抑菌材料進行結合，部分適配體由于其獨特的結構和更加精確的靶標可以實現獨立的抑菌作用。如圖3-B所示，Zhao等［21］篩選了針對丁酰基-高絲氨酸的適配體，實現了對銅綠假單胞菌生物膜形成的抑制。丁酰基-高絲氨酸是由銅綠假單胞菌的rhll基因編碼的?；呓z氨酸內酯合酶合成的rhl系統信號分子。該適配體篩選利用液相結構切換的核酸適配體，經過14輪的篩選，獲得親和力為28.47 nmol/L的適配體。適配體通過與丁?；?高絲氨酸結合，可以導致該信號分子在培養物中保持低水平并阻斷其余rhlR蛋白之間的偶聯，從而實現對銅綠假單胞菌群體感應的干擾，抑制生物膜的形成。未來，這種具有獨立抑菌能力的適配體由于其在使用中具有適配體納米材料抑菌無法比擬的優勢，將被更加廣泛地開發和應用。

3 總結和展望

作為一種具有嚴重危害的致病菌，銅綠假單胞菌的檢測和防治一直是研究的重點，但是其復雜而多樣的毒力因子以及強大的生物膜形成，使其檢測和抑制的難度大大提升，適配體的出現為其靶向治療和早期檢測提供了有利的工具。目前關于銅綠假單胞菌適配體的開發及其應用已經得到了一定程度的開展，但是相較于其他具有嚴重危害的微生物來說，銅綠假單胞菌在適配體篩選、裁剪和應用方面的研究并不豐富，依然具有較大的開發潛力。未來，在銅綠假單胞菌適配體的開發方面，在計算機技術指導下的更理性的篩選和文庫設計工作將深入進行，實現更加科學地適配體篩選，這些理性篩選工作的開展將使現在適配體篩選周期長、適配體候選庫分析工作量大的問題得到進一步的解決，有助于開發出具有更好性能的適配體序列。對于已經篩選得到的眾多適配體，通過裁剪以完成核心結合區域探究的工作，也將得到越來越多研究者的關注，這有利于目前大分子靶標結合原因和結合區域不明現狀的解決，并且對銅綠假單胞菌上的適配體結合靶位點進行確認，也將大大推動適配體在應用方面的快速發展。在應用方面，基于適配體的銅綠假單胞菌檢測將朝著一體化快速檢測設備開發、現場快速檢測應用的方向發展，隨著適配體性能的不斷提升，傳感器的檢測性能也有望進一步提升，在特異性和靈敏度以及活死菌的區分等方面都將不斷發展。在基于適配體的銅綠假單胞菌防治方面，可以直接對菌體進行損傷的適配體開發是值得研究的方向，其應用也將朝著更加有效和精準的方向進行。