bHLH96的克隆及其在薄荷萜烯生物合成調控中的功能

王斌 袁曉，2 蔣園園 王玉昆 肖艷輝 何金明

（1. 韶關學院生物與農業學院 廣東省粵北食藥資源利用與保護重點實驗室，韶關 512005；2. 華南農業大學園藝學院，廣州 510642）

萜烯類化合物是植物中種類最多的次生代謝產物，幾乎存在于所有植物中，具有廣泛的藥理活性，例如抗炎、抑菌殺菌、抗瘧疾和抑制腫瘤等活性［1］，但植物體內萜烯類物質含量低是普遍存在的問題。因此，通過基因工程的方法調控萜烯類化合物的生物合成，提高含量或改良萜烯組成，改良植物種質資源，對于增強萜烯類化合物的藥理活性具有重要意義。唇形科（Labiatae）植物廣泛分布于中國各地，是我國常用的傳統中藥材之一，在全球范圍內已記錄的唇形科植物有200余屬和3 500余種［2］。

薄荷（Mentha haplocalyx Briq.）是唇形科薄荷屬植物，是一種具有很高經濟價值的芳香植物［3］。薄荷自1977年載入《中國藥典》后一直收載至今，具有提高人體細胞滲透性、改善精神疲勞、消炎、祛痰以及促進術后排氣等多種作用［4］。薄荷還可與牛蒡子、連翹、金銀花等草藥配伍，以治療風熱感冒或溫病初起；與白芷石膏、川芎等配伍，可用于治療風熱上攻，如頭暈和眼花；與當歸、白芍、柴胡等草藥組合，對治療肝氣郁結有較好療效［5］。

根據分子結構中含有的異戊二烯單元數，萜烯可細分為單萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜、多萜。盡管部分植物如迷迭香、紅豆杉等植物中的二萜和三萜含量也比較高，但大部分植物中的萜類物質主要以單萜和倍半萜化合物為主，其他類型萜的種類和含量相對較少［6-8］。植物萜烯合成均起始于2個C5異戊二烯單元的前體物質，即異戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate, IPP）和3,3-二甲基丙烯基焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP）［9］。IPP和DMAPP在細胞質中由甲羥戊酸（mevalonate pathway, MVA）途徑合成，在質體中由2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate, MEP）途徑合成［1］。細胞質中主要負責倍半萜和三萜等的生物合成，質體中主要負責單萜和二萜等的合成［10］。但植物萜烯的生物合成是一個極度復雜的過程，萜烯的合成速率和流向還受到萜烯合成酶（terpene synthase, TPS）的直接調控，而TPS表達則直接受轉錄因子等反式作用因子的調控。

轉錄因子是一類可直接調控基因表達的反式作用因子，研究表明，TPS表達受許多轉錄因子的調控。如番茄中SCL（scarecrow-like）家族轉錄因子SlSCL3通過激活相關TPS的表達，正向調控多種揮發性萜的合成［11］。柑橘CitERF71轉錄因子通過激活CiTPS16表達，從而調控甜橙香葉醇的合成和釋放［12］。作為最大的轉錄因子家族之一，bHLH在調控植物萜烯合成中具有重要作用［13-14］。擬南芥bHLH家族轉錄因子AtMYC2直接與AtTPS21和AtTPS11的啟動子結合，激活其表達并促進倍半萜的合成［15］。黃花蒿AabHLH1能直接與AaADS和AaCYP71AV1啟動子中的E-box順式元件結合，促進青蒿素的生物合成［16］。但bHLH轉錄因子家族基因是否參與薄荷萜烯的生物合成，以及其具體調控哪些萜烯組分的合成，國內外少有相關研究報道。

薄荷地上部組織中含有種類和含量豐富的萜烯化合物，尤其以葉片中的萜烯含量最高。在分析前期轉錄組數據時，鑒定了一個在薄荷葉片中高表達的bHLH轉錄因子基因，命名為bHLH96。

本研究從薄荷葉片中克隆出了bHLH96全長序列，分析亞細胞定位和序列特性，并在葉片中分析瞬時過表達對薄荷TPS表達與萜烯含量的影響，為通過代謝或基因工程改良薄荷種質提供重要基因資源，拓展有關植物揮發性次生代謝產物合成途徑與調控機制的認識。

1 材料與方法

1.1 材料

供試薄荷品種為‘恒進高油’，種植于韶關學院生態園芳香植物基地，通過扦插方式無性繁殖。將薄荷莖稈用無菌剪刀剪成長度為5 cm左右的小段，用1∶800的多菌靈溶液浸泡消毒處理薄荷莖段5 min，扦插在混合育苗基質（草炭土∶蛭石=1∶1）上待生根發芽。分別在2020年和2021年3-4月份育苗，當扦插的薄荷小苗生長至10 cm高度時開展后續試驗。

1.2 方法

1.2.1 薄荷葉片和莖的轉錄組測序 扦插生根的薄荷幼苗長至20 cm時，將葉片和莖組織單獨收集，用于轉錄組測序分析。將來自于6株植株的新鮮莖和葉片分開收集在50 mL的離心管中（3個重復，各重復單獨取樣），液氮速凍，-80℃保存。轉錄組測序由北京百邁客生物科技有限公司進行。

使用天根生化科技（北京）有限公司的總RNA提取試劑盒（產品編號：DP441）提取總RNA。用瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的純度和完整性，利用上海翌圣生物科技有限公司的反轉錄試劑盒（產品編號：11141ES）合成cDNA。cDNA文庫構建、轉錄組測序、基因功能注釋等步驟詳見文獻［17］。

測序完成后，將測序結果推送至百邁客云（https://www.biocloud.net/），利用該云平臺分析轉錄組測序數據。差異表達基因的篩選標準為：差異倍數（fold change, FC）≥2.0，q值≤0.01。使用FPKM（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments）值表示基因表達水平［17］，利用TBtools軟件根據FPKM值繪制薄荷葉片和莖中差異表達的bHLH家族基因的表達熱圖。

1.2.2 bHLH96全長序列的克隆 根據轉錄組測序組裝的序列預測編碼區序列（coding sequence, CDS），利用NCBI在線工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast）設計全長特異引物（表1）。以葉片cDNA為模板，使用生工生物工程（上海）股份有限公司的2×高保真PCR Mix（產品編號：B639292）擴增bHLH96全長序列。反應體系：25 μL的2×高保真PCR Mix預混液、正反向引物各2 μL、2 μL的cDNA溶液和19 μL ddH2O。PCR擴增條件：95℃ 3 min；95℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃ 1 min，35個循環；72℃ 5 min。當反應至33個循環時，在每個反應體系中加入10 μL的普通Taq PCR Mix 預混液（產品編號：B639295），在PCR產物末端加A尾，以使PCR產物能與T載連接。

表1 引物信息Table 1 Primer information

PCR產物經凝膠電泳后回收，與pUCm-T載體連接，構建克隆重組載體，轉化DH5α大腸桿菌感受態細胞，篩選陽性克隆進行測序。

1.2.3 亞細胞定位 使用BamH I內切酶將pBI121-GFP載體線性化。將bHLH96全長序列（不含終止密碼子）正向插入到pBI121-GFP載體的BamH I酶切位點處，構建含GFP報道蛋白的亞細胞定位重組載體，由CaMV35S啟動子驅動bHLH96表達，引物信息見表1。重組質粒轉化DH5α感受態細胞，擴繁重組質粒，經測序驗證后轉化GV3101農桿菌感受態。之后使用真空滲透法將陽性單克隆農桿菌打入本氏煙草葉片，試驗用本氏煙草為轉mCherry蛋白的轉基因煙草。共培養48 h后，使用正置熒光顯微鏡（德國蔡司，型號：Axio Imager Z2）觀察轉基因煙草葉片細胞中的mCherry和GFP熒光。

1.2.4 氨基酸序列特性分析 將bHLH96蛋白序列提交至NCBI數據庫中blast，比對得到與該蛋白同源性高的候選蛋白。在候選蛋白中挑選與bHLH96蛋白同源性高的4種模式植物（野生稻、擬南芥、煙草和番茄）的bHLH96蛋白序列，利用DNAMAN v6軟件的多序列比對功能繪制氨基酸序列比對圖片。

在PlantTFDB網站（http://planttfdb.gao-lab.org/index_ext.php）下載擬南芥bHLH家族基因的氨基酸序列，鑒定出與薄荷bHLH96蛋白親緣性最高的擬南芥bHLH蛋白。在NCBI數據庫中查找唇形科植物bHLH家族蛋白，利用獲得的氨基酸序列，使用MEGA7軟件中的鄰接法（neighbor joining, NJ）進行系統發育分析。MEGA7軟件中bootstrap值設置為1 000次，其余參數均為軟件默認。根據bootstrap值將植物bHLH蛋白劃分為不同亞類，亞類分組的閾值為50次。利用WebLogo網站（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）分析bHLH蛋白保守結構域的保守性。

1.2.5 熒光定量PCR（RT-qPCR）分析 使用美國Bio-Rad公司的RT-qPCR儀（型號：CFX Connect）分析基因表達情況，RT-qPCR反應體系：cDNA溶液1 μL、正反向引物各1 μL、PCR mix 10 μL和ddH2O 7 μL。反應程序：95℃ 5 min；95℃ 10 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s，40個循環。在反應的最后增加溶解曲線，按照儀器默認參數增加溶解曲線。以薄荷Actin（NCBI登錄號：KR082011.1）為內參基因，通過2-△△Ct法根據Ct值計算特定基因的表達量［17］。

1.2.6 薄荷葉片中瞬時過表達bHLH96 將bHLH96全長序列正向插入到pBI121-GUS載體的BamH I酶切位點處構建重組pBI121-bHLH96。利用真空滲透法將含重組質粒（OE）和pBI121空載質粒（CK）的GV3101農桿菌分別侵染薄荷葉片，在薄荷葉片中瞬時過表達bHLH96。每處理各使用6株幼苗（約20 cm）用于瞬時過表達分析，每株薄荷選取3-4片幼嫩葉片用于注射農桿菌（老葉細胞壁較厚，農桿菌滲透液不易滲入）。薄荷葉片注射了農桿菌后，在黑暗環境下培養24 h，之后轉移至光周期為16/8 h（光/暗）、溫度為25℃的環境中繼續生長。在7 d時收集葉片，檢測揮發性化合物含量和TPS表達的變化。通過頂空固相微萃取法（GC-MS型號：7890B-5977B，安捷倫科技公司）檢測薄荷葉片中揮發性化合物的種類及含量。

1.2.7 數據分析 在Excel 2016軟件中匯總整理試驗數據，并繪制柱形圖以及分析數據間的相關性。使用SPSS 22軟件中的Student's t-test法檢驗2組樣品間的差異顯著性（P≤0.05），各處理或組織包含3個獨立的生物學重復。

2 結果

2.1 薄荷bHLH基因在不同組織中的表達

通過比較分析葉片和莖的轉錄組學差異，共鑒定到21個bHLH基因在葉片和莖中差異表達。其中，僅bHLH7、bHLH87和bHLH96在葉片中高表達，另外18個bHLH基因在莖中高表達（圖1-A）。推測3個在葉片中高表達的bHLH基因可能正向調控萜烯的生物合成，本研究重點探究bHLH96在薄荷萜烯合成中的調控作用。

圖1 薄荷bHLH家族基因的表達模式及bHLH96的表達Fig. 1 Expression patterns of bHLH family genes and bHLH96 expression

轉錄組測序分析結果顯示，葉片中bHLH96表達量比莖中的表達量高2.59倍（圖1-B）。為驗證轉錄組測序結果的可靠性，采用RT-qPCR法檢測根、莖和葉片中bHLH96的表達情況（圖1-C），bHLH96在根中的表達量最低，在葉片中的表達量最高，在葉片中的表達量比莖中高3.34倍，總體與轉錄組結果一致。盡管bHLH96在薄荷不同組織中組成型表達，其表達模式表現出明顯的組織特異性，且在葉片中顯著高表達，這與揮發性萜烯化合物主要在葉片中合成積累的特性是一致的。初步表明薄荷bHLH96表達與萜烯化合物的含量正相關，可能參與薄荷萜烯類化合物的合成調控。

2.2 薄荷bHLH96全長的克隆

轉錄組測序組裝的薄荷bHLH96全長包含861 bp。以薄荷葉片cDNA為模板，通過RT-PCR法擴增bHLH96全長序列。結果顯示，在750-1 000 bp間有一條DNA條帶（圖2-A），DNA片段大小符合預期。菌落PCR結果（圖2-B）表明，成功獲得轉化重組質粒的陽性單克隆菌落。經測序，獲得薄荷bHLH96的核苷酸序列，推導其氨基酸序列（圖3）。

圖2 薄荷bHLH96的PCR擴增產物電泳圖Fig. 2 Electrophoresis maps of PCR amplification products of peppermint bHLH96 gene

圖3 薄荷bHLH96的核苷酸序列（淺綠色背景）和推導的氨基酸序列（淺藍色背景）Fig. 3 Nucleotide sequence（light green background）and the deduced amino acid sequence（light blue background）of peppermint bHLH96 gene

2.3 薄荷bHLH96蛋白的亞細胞定位

mCherry蛋白具有核定位信號［18］。通過觀察mCherry和GFP蛋白的定位發現，pBI121空載的mCherry蛋白定位在細胞核，GFP蛋白定位在細胞質。但在bHLH96-GFP重組質粒中，mCherry和GFP蛋白均定位在細胞核（圖4）。表明bHLH96是一個核定位蛋白，符合轉錄因子定位在細胞核、在細胞核中發揮轉錄調控作用的特性。

圖4 薄荷bHLH96轉錄因子的亞細胞定位Fig. 4 Subcellular localization of peppermint bHLH96 transcription factor

2.4 薄荷bHLH96氨基酸多序列比對和系統發育分析

為分析薄荷bHLH96蛋白的功能保守性，比較其與4種模式植物（野生水稻、擬南芥、煙草和番茄）bHLH96蛋白的氨基酸序列相似性。5種植物的bHLH96蛋白序列中均含有一個bHLH保守結構域（圖5-A），且保守結構域的保守性很高（圖5-B）。薄荷bHLH96蛋白的氨基酸序列與煙草bHLH96和番茄bHLH96的同源性最高，分別為55.74%和52.73%，與野生水稻和擬南芥bHLH96的氨基酸序列一致性均低于50%。番茄bHLH96與煙草bHLH96蛋白的氨基酸序列一致性最高，為73.68%（表2）。這是因為番茄和煙草同屬于茄科植物，親緣關系更近，序列相似性也更高。薄荷bHLH96與4種模式植物的氨基酸序列相似性較低，意味著bHLH96在植物中具有復雜多樣的生物學功能，bHLH96在薄荷中的生物學功能可能有別于擬南芥等模式植物。

圖5 薄荷bHLH96與模式植物bHLH96氨基酸序列比對（A）和保守結構域保守性分析（B）Fig. 5 Amino acid sequence alignment（A）and conservation analysis of conserved domain（B）of peppermint bHLH96 and bHLH96 from model plants

表2 不同植物bHLH96氨基酸序列一致性比較Table 2 Comparison in the amino acid sequences of bHLH96 proteins in different plant species%

在擬南芥bHLH家族中，AtbHLH96（登錄號：AT1G72210.1）和AtbHLH94（登錄號：AT1G22490.1）與薄荷MbbHLH96蛋白的親緣關系最近。唇形科植物以富含萜烯化合物而著稱［19］。為從系統發育角度證明薄荷bHLH96參與萜烯合成調控，利用擬南芥AtbHLH96和AtbHLH94的氨基酸序列，以及唇形科植物bHLH家族蛋白的氨基酸序列進行了系統發育分析。

根據bootstrap值可將植物bHLH蛋白劃分為2個亞類（圖6）。其中，薄荷MhbHLH96與同屬于唇形科的鼠尾草（Salvia hispanica）ShbHLH96、丹參（Salvia miltiorrhiza）SmbHLH94、薰衣草（Lavandula angustifolia）LaMYC4等bHLH蛋白，以及擬南芥AtbHLH96和AtbHLH94聚在同一分支，丹參SmbHLH10與SmbHLH148聚在另一分支。說明薄荷bHLH96與薰衣草LaMYC4的親緣關系較近，可能與LaMYC4具有相似的生物學功能。

圖6 植物bHLH蛋白系統發育分析Fig. 6 Phylogenetic analysis of plant bHLH proteins

2.5 過表達薄荷bHLH96對葉片萜烯含量的影響

為探究bHLH96是否會影響萜烯化合物的合成，在薄荷葉片中瞬時過表達bHLH96，研究過表達bHLH96對薄荷萜烯含量的影響。與只過表達空載pBI121的對照（CK）相比，過表達bHLH96盡管沒有顯著影響薄荷醇（menthol）等薄荷特征性揮發性組分的相對含量，但顯著影響15種萜烯化合物的相對含量（表3）。其中，OE中11種揮發性化合物的含量顯著高于CK，4種揮發性化合物的含量顯著低于CK。對降低（±）-薄荷酮［（±）-pulegone］含量的作用最明顯，表明bHLH96影響薄荷萜烯化合物的合成。

表3 CK和OE薄荷葉片中的揮發性化合物種類和相對含量Table 3 Types and relative contents of volatile compounds in the leaves of CK and OE peppermint seedlings

2.6 過表達薄荷bHLH96對萜烯合成相關基因表達的影響

由于過表達bHLH96顯著影響薄荷萜烯化合物的相對含量，為此分析過表達bHLH96對TPS相關基因表達的影響。在OE樣品中，bHLH96表達量顯著高于CK（圖7-A），表明bHLH96在薄荷葉片中成功過表達，OE樣品中其他基因表達發生變化是由bHLH96表達增加引起的。瞬時過表達bHLH96顯著上調5個TPS的表達，分別是2,3-氧化鯊烯環化酶基因OC2（2,3-oxidosqualene cyclase 2）、角鯊烯單加氧酶基因SM1（squalene monooxygenase 1）、貝殼杉烯合成酶基因KS1（kaurene synthase 1）、（+）-新薄荷醇脫氫酶基因ND［（+）-neomenthol dehydrogenase］和內根-貝殼杉烯酸氧化酶基因EAO1（ent-kaurenoic acid oxidase 1）；顯著下調3個TPS基因的表達，依次是橙花叔醇/芳樟醇合酶基因NLS1（nerolidol/linalool synthase 1）、異薄荷二烯酮還原酶基因iPR［（-）-isopiperitenone reductase］和檸檬烯合成酶基因LS（limonene synthase）（圖7-B-I）。表明轉錄因子bHLH96通過影響TPS基因相關基因的表達，控制萜合成速率和流向，從而調控萜烯類化合物的生物合成。

圖7 薄荷葉片中瞬時過表達bHLH96對相關TPS基因表達的影響Fig. 7 Effects of transient overexpression of bHLH96 in the peppermint leaves on the expressions of TPS genes

2.7 可能受bHLH96調控的TPS基因表達與萜烯含量的相關性分析

為明確過表達bHLH96導致15種萜烯含量發生變化是否由相關TPS基因表達量改變引起，分析TPS基因表達與萜烯含量的相關性。15種萜烯物質的含量與8個TPS基因的表達量間具有明顯相關性（附表1），且相關性很高，表明bHLH96過表達引起上述萜烯物質含量變化與TPS基因表達密切相關。對萜烯化合物含量而言，bHLH96表達與（E）-2-已烯醛［（E）-2-Hexenal］含量的正相關性最高（R2=0.98），與異胡薄荷醇（isopulegol）含量的負相關性最高（R2=-0.99）。對TPS基因表達而言，bHLH96表達與SM1和KS1表達的正相關性最高（R2=1.00），與iPR表達的負相關性最高（R2=-0.98）。說明bHLH96可能正向調控與其表達呈正相關性的TPS基因，負向調控與其表達呈負相關性的TPS基因，也再次證實一些萜烯含量發生變化是由bHLH96表達量增加引起。

3 討論

bHLH轉錄因子是植物最大的轉錄因子家族之一，在植物生長發育、信號轉導、逆境脅迫反應和次生代謝產物合成調控中具有重要作用［21-23］。植物精油主要在腺毛（trichome）中合成并貯存，而腺毛主要在葉表皮形成并分泌，盡管莖中也含有少量腺毛，但數量甚微［24-25］，暗示著在葉片中高表達的bHLH基因可能調控萜烯物質的生物合成。比較轉錄組學分析或許能鑒定到一些調控萜烯合成的關鍵bHLH家族基因。為此，本研究利用比較轉錄組學分析了bHLH基因家族在薄荷不同組織中的表達模式發現，薄荷bHLH96在葉片中的表達量顯著高于莖中的表達量，RT-qPCR結果也證實bHLH96在葉片中的表達量最高，推測bHLH96可能參與薄荷萜烯化合物的生物合成調控。薄荷是熱帶、亞熱帶地區重要的經濟作物，莖葉通常用于提取精油或作為中草藥，具有很高的經濟價值和藥用價值［26］。但由于品種雜合度高，無性繁殖體細胞容易變異，使得不同品種間的薄荷精油組分差異很大，直接影響精油質量和藥用價值。因此，克隆bHLH96并探究其在薄荷萜烯化合物合成中的調控作用，對于豐富bHLH基因家族的生物學功能具有重要意義，能為薄荷遺傳改良提供重要候選基因。

本研究從薄荷葉片中克隆到了bHLH96的全長序列，其編碼含有286個氨基酸的蛋白質。氨基酸多序列比對結果顯示，本研究所比對植物bHLH96蛋白的氨基酸序列中均含有一個bHLH保守結構域，表明薄荷bHLH96屬于植物bHLH轉錄因子超級家族中的一員。植物bHLH96蛋白的保守結構域保守性很高，但保守結構域外的其他序列存在較大差異，反映在不同植物bHLH96蛋白的氨基酸序列一致性相對較低，這可能是不同植物面對的生長環境和氣候條件存在較大差異的原因。植物面對復雜多變的生長環境和生物與非生物脅迫，可能導致保守結構域外的其他序列發生了一定程度的突變，以適應環境變化。薄荷bHLH96定位在細胞核，與其他植物bHLH蛋白定位在細胞核的特性一致［27-29］，表明薄荷bHLH96在細胞核中發揮轉錄調控作用。薄荷bHLH96與薰衣草LaMYC4等唇形科植物bHLH家族蛋白聚在一個分支，親緣關系很近。LaMYC4被證實直接調控薰衣草中萜烯的生物合成［20］，說明薄荷bHLH96與LaMYC4具有相似的生物學功能，其可能在薄荷萜烯合成調控中具有重要作用。

許多研究表明，植物bHLH家族轉錄因子參與次生代謝產物的合成調控，MYC類轉錄因子是研究最多的bHLH轉錄因子［14］。擬南芥AtMYC2是一個bHLH家族轉錄因子，在擬南芥中過量表達AtMYC2可顯著增加腺毛數目，進而促進腺毛中萜烯類物質的合成［30］。長春花CrMYC1和CrMYC2能與異胡豆苷合成酶（strictosidine synthase, STR）基因啟動子序列的G-box元件結合，直接調控長春花中萜類吲哚生物堿的生物合成［31］。在紫杉中也鑒定到了1個MYC轉錄因子，能與二萜紫杉醇合成途徑中紫杉二烯合酶（taxadiene synthase, TS）基因的啟動子結合，調控靶基因的表達［32］。本研究中，在薄荷葉片中瞬時過表達bHLH96顯著增加11種萜烯化合物的含量，降低4種萜烯含量，顯著上調5個TPS基因的表達，下調3個TPS基因的表達，且受bHLH96影響的TPS基因的表達與萜烯的含量呈明顯相關性，證明bHLH96調控薄荷萜烯化合物的生物合成。

植物萜烯合成速率和流向直接受萜烯合成酶的控制［33］，KS和EAO參與植物二萜類物質的合成調控。KS催化柯巴基焦磷酸（ent-copalyl diphosphate）生成貝殼杉烯［34］。EAO可催化內根-貝殼杉烯酸向GA前體轉化，GA是典型的二萜類物質［35］。OC是三萜化合物生物合成的關鍵酶，能將柔性的線性底物精準地催化環化生成不同骨架結構的三萜產物［36］。本研究中，在薄荷葉片中瞬時過表達bHLH96顯著上調OC2、KS1和EAO1等二萜和三萜合成基因的表達，表明bHLH96正向調控二萜和三萜化合物的合成。NLS、iPR和LS等萜烯合成酶是控制薄荷單萜合成的關鍵酶［37］。ND是一種單萜脫氫酶，參與（+）-新薄荷醇等單萜的合成［38］。本研究中，過表達bHLH96顯著下調單萜合成酶基因iPR、LS和NLS1的表達，卻上調ND1的表達；降低異胡薄荷醇和（±）-薄荷酮等單萜的含量，提高己醛（hexanal）和α-蒎烯（α-pinene）等單萜物質的含量，表明bHLH96復雜地調控薄荷單萜類物質的合成。結果表明，薄荷bHLHL96通過調控TPS基因的表達，控制萜烯合成流向。因此，通過在薄荷中調控bHLH96表達，能豐富薄荷揮發性萜烯物質的種類和相對含量，改善薄荷精油中萜烯類化合物組分，從而改良薄荷的藥用價值。但bHLH96是如何調控這些TPS基因的表達的，尚需通過酵母單雜、雙熒光素酶報道基因實驗等分子生物學研究手段進一步明確。

4 結論

薄荷bHLH96屬于植物bHLH轉錄因子超級家族，是一個核定位蛋白，可能在細胞核中發揮轉錄調控作用。植物bHLH96蛋白的保守結構域保守性很高，薄荷bHLH96與同屬于唇形科的薰衣草LaMYC4的親緣關系較近。在薄荷葉片中瞬時過表達bHLH96顯著影響8個TPS基因的表達，影響15種萜烯化合物的相對含量，表明可能通過調控TPS基因表達，控制萜烯合成流向，從而調控萜烯物質的合成。

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