短小芽孢桿菌對羔羊腸道炎癥和屏障功能的影響

焦帥 付域澤 崔凱 張吉賢 王杰 畢研亮 刁其玉 張建新 張乃鋒

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術重點實驗室，北京 100081；2. 山西農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，太谷 030801）

新生羔羊在脫離母體后，面臨著眾多挑戰(zhàn)，主要是營養(yǎng)水平、環(huán)境條件和微生物的改變，這些改變極易造成羔羊腹瀉。腹瀉發(fā)病率最高時期是羔羊出生后的15 d之內(nèi)［1］。羔羊早期腹瀉影響其生長發(fā)育，對生產(chǎn)性能和腸道健康產(chǎn)生不利影響，輕則生長緩慢，重則死亡。對于集約化養(yǎng)殖場來說，初生羔羊腹瀉是致死的重要原因之一，給養(yǎng)殖場帶來重大經(jīng)濟損失。因此，預防初生羔羊腹瀉是目前需要解決的難題。腸道微生物群和宿主健康之間的關系引發(fā)了人們對添加益生菌來防治動物疾病的關注。由于芽孢桿菌能形成孢子，較其它細菌來說更有利于在胃腸道環(huán)境中存活［2］，且方便儲存和運輸［3］，因此芽孢桿菌常被用作人類和多種動物的益生菌補充劑［4］。短小芽孢桿菌是一類需氧或兼性厭氧的革蘭氏陽性菌，參與生物奪氧，維持胃腸道厭氧環(huán)境［5］；促進動物腸道和機能的成熟；分泌抗菌素、抗菌肽和抗菌蛋白等多種抗菌物質(zhì)［6］。

前人研究表明，添加短小芽孢桿菌可增強肉雞免疫力，調(diào)節(jié)腸道菌群，改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，提高肉雞穩(wěn)定性［7-8］。其次，短小芽孢桿菌在提高水生動物生長、免疫和抗病力方面具有很大潛力［9-10］。Zhang等［11］通過探究短小芽孢桿菌對斷奶金堂黑山羊瘤胃和腸道形態(tài)及微生物區(qū)系的影響發(fā)現(xiàn)，其對瘤胃和小腸發(fā)育有促進作用，并且通過增加腸道有益細菌的豐度來調(diào)節(jié)微生物群落，以促進營養(yǎng)代謝和健康狀況。但短小芽孢桿菌能否通過改善腸道健康緩解羔羊腹瀉還未有研究。本試驗假設添加適當劑量的短小芽孢桿菌可以緩解腸道炎癥反應、增強腸道屏障功能，最終緩解羔羊腹瀉。本研究通過在代乳粉中添加短小芽孢桿菌，研究其對新生羔羊生長性能、腹瀉、血清指標、結(jié)腸組織形態(tài)、炎癥細胞因子和緊密連接蛋白含量的影響，為短小芽孢桿菌在反芻動物中的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 試驗所用短小芽孢桿菌為實驗室保存在中國普通微生物菌種保藏管理中心的一株專利菌，名為短小芽孢桿菌315，保藏號編號為CGMCC NO.8878。將菌液擴增之后放于4℃冰箱保存，并測定其活菌數(shù)為1×108CFU/mL，用于后續(xù)試驗。

1.1.2 試劑 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、二胺氧化酶和D-乳酸試劑盒，炎癥細胞因子和緊密連接蛋白ELISA檢測試劑盒均購自北京金海科隅生物科技發(fā)展有限公司，生理鹽水、蘇木精、福爾馬林等均購自系統(tǒng)平臺。

1.1.3 儀器 科華ZY KHB-1280全自動生化儀（上海科華生物工程股份有限公司），BA210Digital數(shù)碼三目顯微攝像系統(tǒng)（廈門麥克奧迪實業(yè)集團有限公司），ST-360酶標儀（上海科華生物工程股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 選用36只初生重3 kg左右的1日齡薩能奶山羊公羔，采用單因素隨機設計，分為4組，每組9個重復，每重復1只羔羊。4組分別為CON組（無菌液，飼喂10 mL生理鹽水），BP1組（飼喂1 mL菌液，9 mL生理鹽水），BP5組（飼喂5 mL菌液，5 mL生理鹽水），BP10組（飼喂10 mL菌液，無生理鹽水）。羔羊經(jīng)過養(yǎng)殖場出生保健程序，在1日齡即開始灌服菌液，每天灌服一次，連續(xù)灌服14 d。本研究經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所動物倫理委員會批準（IFR-CAAS-20220822），實驗過程中實施了人道的動物護理和處理程序。

1.2.2 飼養(yǎng)管理 試驗前對圈舍進行清洗和消毒，羔羊出生后即與母羊分離，在試驗期的14 d，前3 d飼喂初乳，之后飼喂代乳粉，代乳粉營養(yǎng)水平見表1。短小芽孢桿菌菌液（以及生理鹽水）混在50 mL初乳（存放于冰箱中，飼喂時需加熱）或代乳粉中使用奶瓶灌服，飼喂時初乳或代乳粉溫度保持在42℃，確保50 mL初乳或代乳粉飼喂完后，讓羔羊自由采食（不限量）。初乳或代乳粉每天飼喂3次，飼喂時間為上午8點、下午2點和晚上8點，其中第一次飼喂時添加菌液，而后二次不添加。每天消毒打掃衛(wèi)生，圈舍溫度保持在20-30℃。羔羊保健程序按羊場日常管理進行。

表1 代乳粉營養(yǎng)水平Table 1 Nutrient levels of milk replacer

1.2.3 樣品采集與指標檢測

1.2.3.1 生長性能及腹瀉情況 在試驗開始第1天和第15天早上對羔羊進行稱重，并且每天記錄其采食量，用以計算平均日增重、平均日采食量和料重比。試驗期間每天下午觀察羔羊腹瀉和健康狀況，并對其糞便進行評分。采用1-4分制進行糞便評分［12］，糞便正常、干燥成型計1分，糞便柔軟呈布丁狀記2分，糞便流動呈糊狀記3分，糞便呈液體狀記4分，糞便評分≥2記為1次腹瀉。糞便評分=糞便評分總和/（試驗天數(shù)×羔羊數(shù)）［13］，腹瀉頻率=（腹瀉羔羊數(shù)×腹瀉天數(shù)）/（總羔羊數(shù)×試驗天數(shù)）×100%［11］。

1.2.3.2 血清指標 正飼期第14天，每組隨機選取6只羔羊，采用頸靜脈采血法采集10 mL血液，3 000 r/min離心15 min，將血清分裝于1.5 mL離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩２捎蒙y定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase, ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase, AST）、二胺氧化酶（diamine oxidase, DAO）和D-乳酸（D-lactase, LD）的含量。

1.2.3.3 結(jié)腸組織形態(tài) 正飼期第15天，每組隨機選取6只羔羊屠宰，屠宰后從空腸和結(jié)腸中段剪取2 cm長的腸環(huán)，用生理鹽水洗去腸環(huán)中的內(nèi)容物，之后將腸段組織置于裝滿10%福爾馬林的10 mL離心管中，保證腸段完全浸沒在福爾馬林中，用來切片觀察腸道炎癥細胞。固定組織并使用全自動脫水機進行脫水，使用石蠟進行包埋，切片，使用蘇木精和伊紅染色，最后用中性樹膠封固。采用顯微攝像系統(tǒng)對切片進行圖像采集，每張切片先于低倍鏡下觀察全部組織，選擇要觀察的區(qū)域采集圖片，將采集到的圖片導入Motic Images Advanced 3.2，選擇工具欄里的測量選項，調(diào)整物鏡的倍數(shù)（4×）及測量數(shù)據(jù)的單位（μm），選擇折線和直線工具測量所需數(shù)據(jù)。測定指標包括隱窩深度、黏膜厚度和肌層厚度。

1.2.3.4 炎癥細胞浸潤 每張切片先于低倍鏡下觀察全部組織，選擇要觀察的區(qū)域采集400倍鏡下炎癥細胞（中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞）的圖片，進行計數(shù)。

1.2.3.5 炎癥細胞因子和緊密連接蛋白含量 屠宰后取空腸和結(jié)腸中段，縱向剖開腸段，用生理鹽水沖洗掉腸道內(nèi)容物，之后用載玻片刮取并收集黏膜至2 mL凍存管中，置于液氮中，后續(xù)放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎妹嘎?lián)免疫法測定黏膜中白細胞介素1β（interleukin-1β, IL-1β）、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）、γ干擾素（interferon-γ, IFN-γ）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferater-activated receptor gamma, PPARγ）、總蛋白（total protein, TP）、黏蛋白2（mucoprotein2, MUC2）、閉合蛋白1（claudin-1）、閉合蛋白4（claudin-4）、咬合蛋白（occludin）、閉合小環(huán)蛋白1（zonula occludens-1，ZO-1）的含量，黏膜樣品在室溫解凍后，加入適量的生理鹽水勻漿，3 000 r/min離心10 min取上清。使用ELISA檢測試劑盒進行提取，之后使用ST-360酶標儀上機檢測。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS26.0軟件進行單因素方差分析，差異顯著時采用Duncan氏法進行多重比較，并采用線性和二次回歸分析飼糧中短小芽孢桿菌的劑量效應。P ＜ 0.05為差異顯著，0.05 ≤P ＜ 0.10為有變化趨勢。

2 結(jié)果

2.1 短小芽孢桿菌對生長性能和腹瀉的影響

由表2可知，試驗所用羔羊初始體重無顯著差異，符合試驗設計要求。飼喂短小芽孢桿菌對羔羊末重、平均日增重、平均日采食和料重比均無顯著影響（P ＞ 0.05）。隨著短小芽孢桿菌添加水平的增加，羔羊糞便評分和腹瀉頻率呈二次曲線變化；與對照組相比，BP1組、BP5組、BP10組糞便評分和腹瀉頻率顯著降低（P ＜ 0.05）。

表2 短小芽孢桿菌對羔羊生長性能和腹瀉的影響Table 2 Effects of B. pumilus on the growth performance and diarrhea of goat kids

2.2 短小芽孢桿菌對血清生化指標的影響

由表3可知，血清中AST和D-乳酸含量隨著短小芽孢桿菌添加水平的增加呈現(xiàn)二次曲線變化（P＜ 0.05），BP1組AST含量顯著低于對照組（P ＜ 0.05），DAO含量顯著低于對照組和BP5組（P ＜ 0.05）。與對照組相比，BP1組、BP5組、BP10組均顯著降低了血清中D-乳酸含量（P ＜ 0.05）。添加短小芽孢桿菌對ALT含量無顯著影響（P ＞ 0.05）。

表3 短小芽孢桿菌對羔羊血清生化指標的影響Table 3 Effects of B. pumilus on the serum biochemical indices of goat kids

2.3 短小芽孢桿菌對腸道炎癥細胞因子的影響

由表4可知，隨著飼糧中短小芽孢桿菌添加水平的增加，結(jié)腸中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、PPARγ含量呈現(xiàn)二次曲線變化（P ＜0.05）。與對照組相比，BP1組、BP5組和BP10組均顯著降低了IL-1β、IL-6、TNF-α含量（P ＜ 0.05），顯著增加了IL-10、TGF-β、IFN-γ、PPARγ的含量（P＜ 0.05）。且BP1組、BP5組、BP10組組間無顯著差異（P ＞ 0.05）。

表4 短小芽孢桿菌對炎癥細胞因子的影響Table 4 Effects of B. pumilus on inflammatory factors

2.4 短小芽孢桿菌對炎癥細胞浸潤的影響

隨著短小芽孢桿菌添加水平的增加，視野下中性粒細胞數(shù)量呈線性降低（P ＜ 0.05，表5），飼糧中添加短小芽孢桿菌對結(jié)腸中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞數(shù)量無顯著影響（P ＞ 0.05），但與對照組相比，BP1組、BP5組和BP10組中性粒細胞數(shù)量均降低。短小芽孢桿菌對結(jié)腸炎性細胞浸潤的影響見圖1，對照組中可見胞質(zhì)呈淡紅色，細胞核呈桿狀或分葉狀的中性粒細胞明顯多于試驗組，組織病理改變程度較嚴重，試驗組結(jié)腸組織病理改變程度相對較輕。

圖1 短小芽孢桿菌對羔羊結(jié)腸上皮炎性細胞浸潤的影響（HE染色，400×；中性粒細胞（↑）淋巴細胞（↑）巨噬細胞（↑））Fig. 1 Effects of B. pumilus on inflammatory cell infiltration in the colonic epithelium of goat kids（hematoxylin-eosin staining, 400×; neutrophil（↑）, lymphocyte（↑）, macrophages（↑））

表5 短小芽孢桿菌對炎癥細胞數(shù)量的影響Table 5 Effects of B. pumilus on the number of inflammatory cells

2.5 短小芽孢桿菌對結(jié)腸組織形態(tài)的影響

隨著短小芽孢桿菌添加水平的增加，結(jié)腸肌層厚度呈二次曲線變化（P ＜ 0.05，表6）。與對照組相比，BP1組顯著增加了結(jié)腸肌層厚度（P ＜ 0.05）。飼糧中添加短小芽孢桿菌對結(jié)腸隱窩深度、黏膜厚度以及杯狀細胞數(shù)量無顯著影響。圖2為HE染色后在顯微攝像系統(tǒng)中采集的40倍下結(jié)腸形態(tài)的圖片。

圖2 羔羊結(jié)腸上皮組織形態(tài)結(jié)構(gòu)（HE染色，40×；隱窩深度（綠色），黏膜厚度（紅色），肌層厚度（黃色））Fig. 2 Colonic morphology and structure of goat kids（hematoxylin-eosin staining, 40×；crypt depth（green），mucosal thickness（red），and muscular thickness（yellow））

表6 短小芽孢桿菌對結(jié)腸組織形態(tài)的影響Table 6 Effects of B. pumilus on colonic morphology μm

2.6 短小芽孢桿菌對結(jié)腸緊密連接蛋白的影響

由表7可知，飼糧中添加短小芽孢桿菌對結(jié)腸總蛋白含量無顯著影響（P ＞ 0.05）。隨著飼糧中短小芽孢桿菌添加水平的增加，MUC2、Claudin-1、Claudin-4、Occludin、ZO-1蛋白含量呈現(xiàn)二次曲線變化（P ＜ 0.05）。與對照組相比，BP1組、BP5組和BP10組均顯著提高了結(jié)腸黏膜中MUC2、Claudin-1、Claudin-4、Occludin和ZO-1的含量（P ＜ 0.05）。且BP1組、BP5組、BP10組組間無顯著差異（P ＞ 0.05）。

表7 短小芽孢桿菌對結(jié)腸緊密連接蛋白的影響Table 7 Effects of B. pumilus on colonic tight junction protein

3 討論

在畜牧養(yǎng)殖中，新生羔羊腹瀉是常見的一種疾病。受腹瀉的影響，羔羊早期生長發(fā)育受到影響，對日后的生產(chǎn)性能以及腸道健康造成不可逆的危害，因此，預防初生羔羊腹瀉，是當前需要解決的一大難題。本研究在羔羊一出生就飼喂短小芽孢桿菌發(fā)現(xiàn)，在15 d內(nèi)顯著降低了羔羊的糞便評分和腹瀉頻率，而腸道炎癥反應過度、屏障功能障礙是引起羔羊腹瀉的主要內(nèi)因。進一步通過對血清相關指標以及炎性細胞因子和炎性細胞浸潤的探究發(fā)現(xiàn)，對炎癥反應有一定緩解作用。除此之外，短小芽孢桿菌還增加了結(jié)腸肌層厚度和緊密連接蛋白的含量，增強了羔羊結(jié)腸的物理屏障和化學屏障。但在本試驗中，短小芽孢桿菌對羔羊的日增重、日采食量和料重比無顯著影響。Truong等［14］研究表明添加解淀粉芽孢桿菌54A和短小芽孢桿菌47B的混合益生菌，改善了條紋鯰魚的健康狀況和生長性能。黃坤鵬［15］研究表明短小芽孢桿菌SE5可以促進石斑魚生長，提高其非特異性免疫功能和存活率，調(diào)節(jié)和改善腸道菌群平衡。在反芻動物的研究中，短小芽孢桿菌fsznc-09通過改善瘤胃和腸道微生物區(qū)系來促進斷奶金堂黑山羊生長和健康［11］。在不同動物的不同時期飼喂不同類型的菌株［16］，其產(chǎn)生的效果不盡相同，這可能是生長性能出現(xiàn)差異的原因。與本試驗設計不同，Zhang等［11］未設置添加劑量梯度，添加量為1×109CFU/mL，每2 d飼喂一次。本試驗中不同短小芽孢桿菌添加劑量之間并沒有呈現(xiàn)差異性，需要后續(xù)試驗進一步調(diào)整添加劑量梯度，闡明適宜的添加劑量。

動物機體組織器官發(fā)生損傷或病變，血清生化指標也會相應改變。ALT和AST主要參與肝臟的物質(zhì)代謝，當肝臟出現(xiàn)炎癥時，血清中AST和ALT含量會有所上升［17］。本試驗中添加短小芽孢桿菌降低了AST含量，說明其具有緩解肝臟炎癥的潛力。IL-10作為公認的抗炎細胞因子，在調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)、抑制炎癥介質(zhì)釋放、促進自然免疫和特異性免疫等方面發(fā)揮重要作用［18］。先前的研究表明，缺乏IL-10可能會導致腸道炎癥和慢性腸道炎癥［19］。IL-1β、IL-6和TNF-α是最重要的促炎細胞因子，在炎癥的發(fā)生和發(fā)展中起關鍵作用［18］。細胞因子的過度表達可導致不受控制的全身炎癥，并導致感染性休克和壞死性小腸結(jié)腸炎。越來越多的證據(jù)表明，益生菌在腸道中定植，有助于形成抗菌環(huán)境，減少促炎細胞因子的產(chǎn)生。有報道稱，芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物可激活NF-κB信號和NLRP3炎癥體，并抑制IL-1β的分泌［20-21］。此外，肉仔雞空腸和回腸黏膜中IL-1β、IL-6和TNF-α水平隨著飼糧中解淀粉芽孢桿菌CECT 5940添加量的增加而降低［22］。我們目前的研究也得到了類似的結(jié)果，其中補充短小芽孢桿菌降低了IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，并增加了IL-10的水平。這可能的原因是活化的PPAR-γ介導抑制細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的生成，產(chǎn)生抗炎癥作用。TGF-β可以通過抑制巨噬細胞炎癥因子的產(chǎn)生，進而減輕炎癥反應造成的腸道黏膜損傷［23］。本試驗中添加短小芽孢桿菌增加了IFN-γ含量，IFN-γ的異常產(chǎn)生與自身免疫和腸道菌群的改變有關。IFN-γ雖然是一種對抗許多致病微生物感染的有效分子，但其過度激活會引起組織損傷、壞死和炎癥［24］。腸道炎癥最具代表性的組織學特征之一為活化的中性粒細胞浸潤［25］。本試驗HE染色的結(jié)果表明，添加短小芽孢桿菌降低了炎性細胞浸潤，減輕了腸道病理改變程度，與腸道炎癥細胞因子變化相一致。綜上所述，短小芽孢桿菌可減輕炎癥反應，對羔羊腸道健康有促進作用。

擁有完整的腸道屏障是機體維持正常功能和健康的基礎，腸道屏障一旦被破壞，就無法阻止病原體和內(nèi)毒素進入血液和器官［26］。血清中DAO和LD含量是衡量腸道通透性的重要指標。本研究中添加短小芽孢桿菌使得血清中DAO和LD含量降低，說明DAO和LD難以通過腸道黏膜屏障進入外周血液中，因此腸道的通透性降低。腸道形態(tài)學的完整通常被認為是一種重要的機械防御屏障，腸道絨毛高度的降低和隱窩深度的增加與腸道屏障功能受損有關［27］。覆蓋腸道的黏膜層由整個胃腸道的杯狀細胞分泌，本研究中添加短小芽孢桿菌增加了肌層厚度，可能是由于短小芽孢桿菌改善了腸道微生物區(qū)系。其次，肌層厚度和蠕動速率成正比，理論上應增加飼料的消化率，對生長性能有一定改善作用，但本試驗中日采食量并沒有提高，可能與羔羊日齡太小和飼喂時間太短有關，這仍需我們進一步探究。完整的腸道腸黏膜屏障由單層柱狀上皮細胞和上皮細胞之間的緊密連接組成，緊密連接由40種不同的蛋白組成，主要為跨膜蛋白（如claudins和occludins）和輔助蛋白（zonula occludens, ZOs），這些主要的整合膜蛋白通過與肌動蛋白細胞骨架結(jié)合，維持腸道屏障的完成，調(diào)節(jié)腸道通透性［28］。本試驗中，Claudin-1、Claudin-4、Occludin和ZO-1的含量增加，類似地，Sheng等［29］發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌通過上調(diào)緊密連接蛋白表達來減少上皮屏障損傷。在鼠模型中，應激狀態(tài)下釋放促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子激活神經(jīng)元和肥大細胞促進杯狀細胞MUC2分泌，可以說這是腸道應對應激的一種保護機制［30］。而且有研究表明，內(nèi)層黏液MUC2分泌不足或結(jié)構(gòu)改變可能促進結(jié)腸炎的發(fā)生，Lu等［31］發(fā)現(xiàn)MUC2缺陷導致4周齡小鼠自發(fā)炎癥反應，導致腸上皮屏障功能的降低和細胞增殖的減少，因此，本試驗中添加短小芽孢桿菌增加了MUC2含量，對腸道健康可能產(chǎn)生有益作用。綜上，添加短小芽孢桿菌降低了腸道通透性，增強了腸道屏障功能。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果證實了短小芽孢桿菌可通過增強腸道屏障功能緩解羔羊腹瀉。本試驗條件下，初生羔羊飼喂短小芽孢桿菌可以降低羔羊糞便評分和腹瀉頻率，改善結(jié)腸組織形態(tài)，調(diào)節(jié)炎性細胞因子含量及相關血清指標，增加結(jié)腸緊密連接蛋白含量，減少組織炎性細胞浸潤，但未能發(fā)現(xiàn)其對生長性能有顯著影響。