薄荷茉莉酸受體McCOI1a基因的克隆與表達模式分析

唐偉林 康琴 汪霞 諶明洋 孫欣江 王棵 侯凱 吳衛(wèi) 徐東北

（1. 四川農業(yè)大學農學院，成都 611100；2. 四川農業(yè)大學草業(yè)科技學院，成都 611100）

薄荷（Mentha canadensis L.）是唇形科（Lamiaceae）薄荷屬（Mentha）多年生草本植物，是我國常用中藥材之一，薄荷葉中含有揮發(fā)性成分，俗稱“精油”，是其主要的藥用活性成分，而以其干燥的地上部分入藥，具有清利頭目、宣散風熱、透疹等功效［1］。同時，薄荷也是一種具有特種經濟價值的芳香作物，常用作景觀綠化植物，亦是食品添加劑、化妝品、香料等工業(yè)的重要原材料。目前，干旱、金屬離子、高鹽等非生物脅迫嚴重制約薄荷屬植物的產量和品質［2-4］，由于薄荷缺乏基因組信息，以及抗逆基因資源的挖掘與功能研究匱乏，導致薄荷相關的分子生物學研究進展緩慢，而利用基因工程手段對薄荷進行種質改良尚處于起步階段。因此深入了解薄荷抗逆性建成的分子機制，挖掘出改良薄荷抗性與品質的候選基因顯得尤為重要。

茉莉酸（jasmonic acid, JA）是一種重要的植物生長調節(jié)劑，在植物的生長發(fā)育、逆境抵抗和次生代謝產物合成與調控中具有重要作用［5］。擬南芥（Arabidopsis thaliana）中JA信號轉導模式的研究已較為清楚，JA受體AtCOI1（coronatine insensitive 1）是SKIP1/CULLIN/F-box（SCFCOI1）復合物的重要組成成員，其特征是含有保守的F-box結構域和亮氨酸富集的重復（leucine-riched repeat, LRR）序列，并且COI1蛋白具有茉莉酸-異亮氨酸（jaisoleucine, JA-Ile）共軛物結合活性和E3泛素連接酶活性［6］。植物受到外界非生物脅迫刺激后體內產生的JA與Ile結合形成具有生物活性的JA-Ile，JA-Ile被COI1識別并結合，促進COI1和JA信號抑制子JAZ（jasmonate ZIM-domain, JAZ）蛋白之間的相互作用，導致JAZ蛋白被泛素化后進入26S蛋白酶體降解，隨后釋放出多種不同類型的轉錄因子（包括MYC2、MYB、NAC、WRKY等）以調節(jié)下游基因表達［7］，表明COI1蛋白在JA信號起始中發(fā)揮著關鍵作用。

研究表明，擬南芥AtCOI1基因突變體coi1中JA誘導的基因幾乎不表達，并表現(xiàn)出雄性不育、根的生長對JA處理不敏感以及對病蟲害的抗性降低［8］，水稻（Oryza sativa）稻縱卷葉螟浸染顯著誘導OsCOI1上調表達，沉默OsCOI1降低了水稻對稻縱卷葉螟的抗性［9］，而敲除水稻OsCOI1b延遲了黑暗誘導的葉片衰老［10］。小麥（Triticum aestivum）中鑒定到8個候選COI1基因，并且它們受高鹽、干旱、低溫誘導表達［11］，沉默玉米（Zea mays）ZmCOI2a和ZmCOI2b降低了配子體育性［12］。甘蔗（Saccharum spontaneum）中鑒定到31個候選COI1基因，其中21個ShCOI1基因受干旱、低溫誘導表達［13］。另外，AtCOI1介導JA誘導的花青素合成基因DFR的表達，調節(jié)花青素的積累［14］。在青蒿（Artemisia annua）［15］、丹參（Salvia miltiorrhiza）［16］、長春花（Catharanthus roseus）［17］、煙草（Nicotiana tabacum）［18］中分別克隆得到了候選COI1基因，并且它們可能分別參與JA誘導的青蒿素、丹參酮、生物堿等的合成過程，上述結果表明COI1基因在植物抗性改良和有效活性成分合成調控中的巨大作用。目前，薄荷屬植物COI1基因的研究很少，導致我們對薄荷中JA信號的轉導模式和機制了解較為匱乏。Xu等［19］前期在薄荷中鑒定得到一個McCOI1a基因，該基因與JA信號的抑制子JAZ蛋白在酵母中以冠菌素依賴的方式互作，但對其在非生物脅迫響應方面的研究鮮有報道。

本研究基于課題組從薄荷中克隆得到的JA受體McCOI1a基因，通過生物信息學方法對McCOI1a基因的理化性質和蛋白特征進行分析，并明確其亞細胞定位情況，同時利用RT-qPCR技術分析該基因在薄荷不同組織、不同葉序以及干旱、鹽、金屬離子等非生物脅迫條件下的表達，探究McCOI1a與薄荷JA信號轉導、器官發(fā)育、逆境響應之間的關系，為今后進行薄荷分子育種提供科學依據。同時為探究不同植物體內茉莉酸信號受體蛋白COI1的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料是2015版《中國藥典》在錄薄荷，采自陜西渭南，由四川農業(yè)大學農學院特用植物生產學系徐東北副教授提供。薄荷、本氏煙草（Nicotiana benthamiana）種植于光照培養(yǎng)箱，23℃，光照16 h/黑暗8 h；亞細胞定位所用材料為5周齡本氏煙草；薄荷不同組織、不同葉序材料分別采自生殖生長期（2月齡）和營養(yǎng)生長期薄荷（5周齡）；脅迫處理材料為長勢一致的水培薄荷幼苗。

1.2 方法

1.2.1 薄荷McCOI1a基因鑒定 從國家生物技術信息中心下載薄荷轉錄組數據（SRP132644），利用BioEdit軟件建立本地蛋白數據庫，從TAIR（https://www.arabidopsis.org/）網站下載擬南芥AtCOI1蛋白序列。采用本地BLASTP法進行序列檢索與比對，篩選具有F-box以及LRR保守結構域的候選基因序列。同時，利用SMART在線網站（http://smart.emblheidelberg.de/）驗證候選序列中含有的COI1蛋白保守結構域，鑒定得到薄荷McCOI1a基因。

1.2.2 薄荷McCOI1a基因克隆與測序驗證 收集2周齡的薄荷幼嫩葉片，液氮冷凍后研磨成粉末，根據天根RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441）所述步驟提取葉片總RNA。基因克隆和RT-qPCR的cDNA第一鏈合成均采用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）（R212,vazyme）。基于McCOI1a基因編碼序列，利用DNAMAN軟件設計基因全長擴增引物（McCOI1a-F：5'-ATGGAGGATGGTGGGAAATC-3'； McCOI1a-R：5'-TCAAGCATTAAGGAGAAAAG-3'）擴增McCOI1a，PCR擴增體系如下：1 μL 5×cDNA模板、F和R引物各0.5 μL、5 μL 5×PrimeSTAR DNA聚合酶緩沖液、2 μL PrimeSTAR? DNA聚合酶、16 μL ddH2O，總體積25 μL。PCR擴增程序如下：95℃ 10 min；95℃15 s，55℃ 20 s，72℃ 2 min（1 kb/min），34個循環(huán)；72℃ 10 min，4℃ 1 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定分離，按照博邁德（Biomed）DNA膠回收試劑盒（DH103-01）所述步驟回收McCOI1a基因的PCR產物，Nandrop2000測定PCR產物濃度備用。根據北京擎科生物技術有限公司的pClone007 Blunt Vector Kit（TSV-007B）所述步驟，將PCR產物與pClone007載體連接，連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，挑取單克隆進行液體培養(yǎng)后，利用菌液PCR對重組子進行鑒定，將含有目的片段的陽性菌液送至北京擎科生物技術有限公司進行測序，確認McCOI1a基因［19］序列的正確性。

1.2.3 薄荷McCOI1a基因生物信息學分析 將拼接的序列進行生物信息學分析，使用ExPASy網站（http://us.expasy）預測McCOI1a蛋白的序列特征和理化性質，獲得蛋白的穩(wěn)定性指數、蛋白理論等電點（pI）和分子量（MW）等信息。使用SignalP-6.0工具預測候選McCOI1a蛋白的信號肽。使用SOPMA網站和SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org）基于McCOI1a的氨基酸序列分析蛋白二級結構和3D結構。根據McCOI1a的氨基酸序列，在NCBI網站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行BLASTP同源比對，下載同源基因的氨基酸序列，使用DNAMAN6.0軟件對McCOI1a及其同源蛋白進行多重序列比對，分析氨基酸序列相似性。使用MEME（https://memesuite.org/meme/）在線工具，分析McCOI1a及其同源蛋白保守結構域組成、位置及結構域內每個位點上的保守氨基酸的頻率。從Phytozome v13（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）數據庫中下載擬南芥（A. thaliana）、水稻（O. sativa）、番茄（Solanum lycopersicum）、芝麻（Sesamum indicum）、大豆（Glycine max）、葡萄（Vitis vinifera）、長春花（C. roseus）、丹參（S. miltiorrhiza）、碧桃（Prunus persica）、苜蓿（Medicago truncatula）、甜櫻桃（Prunus avium）、甘薯（Ipomoea batatas）、甘藍型油菜（Brassica napus）、野茶樹（Camellia sinensis）、橡膠樹（H. brasiliensis）的COI1蛋白序列。使用MEGA5.0軟件，采用鄰接法（neighbor-joining method, NJ）構建系統(tǒng)進化樹，利用iTOL網站（https://itol.embl.de/）對發(fā)育樹進行美化。

1.2.4 薄荷McCOI1a-GFP融合載體構建及蛋白亞細胞定位分析 根據同源重組原理，設計McCOI1a編碼序列的同源重組PCR擴增引物（McCOI1a-G-F:5'-ACTCTTGACCATGGTAGATCTGATGGAGGATGGTGGG AAAT-3'；McCOI1a-G-R: 5'-TCTTCTCCTTTACTAGT AGCATTAAGGAGAAAAG-3'），下游引物去掉終止密碼子，以pClone007-McCOI1a質粒為模板進行PCR擴增，反應體系如下：2×ApexHF FS PCR Master Mix 12.5 μL、F和R引物各0.5 μL、模板質粒1 μL、ddH2O 10.5 μL；PCR程序如下：94℃ 5 min；95℃15 s，50℃ 20 s，72℃ 45 s（1 kb/5 s），34個循環(huán)；72℃ 10 min，4℃ 1 min。pCAMBIA1302-GFP（green fluorescent protein）載體經Bgl II和Spe I雙酶切，酶切體系：10×CutoneTM buffer 3 μL、Bgl II和Spe I各3 μL、質粒3 μg，補水至30 μL。PCR產物和載體酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收備用。根據CloneExpress? II One Step Cloning Kit（C112, vazyme）的操作說明，將PCR產物連接至pCAMBIA1302GFP載體上，連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，PCR鑒定陽性菌液送北京擎科生物技術有限公司測序驗證。

將正確的重組載體pCAMBIA1302-McCOI1a-GFP（McCOI1a-GFP）、空載體pCAMBIA1302GFP（GFP）以及課題組保存的核定位marker載體PHB-SV40-mcherry（SV40-mcherry）分別通過凍融法轉化農桿菌菌株GV3101。參照Ma等［20］煙草注射方法，將攜帶McCOI1a-GFP、GFP空載體的GV3101重懸液分別與含有SV40-mcherry的GV3101重懸液以1∶1比例混和均勻后，將重懸液注射到5周齡的本氏煙草的葉片中，煙草置于黑暗條件16 h，隨后正常培養(yǎng)2 d，使用激光共聚焦熒光顯微鏡檢測GFP信號，每個組合實驗重復3次。

1.2.5 McCOI1a基因的表達分析 取正常生長2個月并且長勢一致的薄荷植株9株，將3株薄荷相同位置處的不同組織，包括：根、莖、嫩葉、老葉、花、蕾、莖尖分別混合取樣，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩Ａ硗猓暨x生長一致的薄荷幼苗摘取地上部進行水培，待根系生長茂盛（約3周）時，選取長勢一致的薄荷植株，用吸水紙快速將根部水分擦干，分別置于150 μmol/L NaCl、100 μmol/L AlCl3、100 μmol/L CuCl2、100 μmol/L CdCl2、100 μmol/L methyl jasmonate（MeJA）水溶液中進行處理。將表面水分吸干的薄荷置于干燥的濾紙上進行干旱處理，在處理后的 0、1、3、6、12、24 h將葉片、根分別取樣，液氮速凍-80℃保存?zhèn)溆茫鲜雒總€處理設置3個生物學重復。總RNA提取及反轉錄方法參照1.2.2所述。

根據McCOI1a基因序列，利用DNAMAN軟件設計基因特異引物（qMcCOI1a-F: 5'-CCGATGAAGGACTGTTGGAG-3'；qMcCOI1a-R: 5'-CTCGATGGAATCAGCTCAATG-3'）。以薄荷β-actin為內參基因，設計內參引物（β-actin-F: 5'-CCAGGAATTGCTGATAGGATGAG-3'；β-actin-R: 5'-GCGCCACCACCTTAATCTTC-3'）。利用伯樂（Bio-rad）CFX96TM qPCR儀進行熒光定量試驗。PCR反應體系如下：2×SYBR Green Pro Taq HS Premix 10 μL、F和R引物各0.5 μL、10×cDNA模板2 μL、ddH2O 7 μL。PCR程序如下：95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)，每個樣品3個重復。采用2-ΔΔCt法計算McCOI1a的相對mRNA表達量，并利用IBM SPSS Statistics 26軟件進行顯著性分析。

2 結果

2.1 薄荷McCOI1a基因克隆與編碼蛋白的氨基酸序列分析

以薄荷cDNA為模板，通過RT-PCR實驗獲得了目的基因McCOI1a，該基因全長編碼序列1 842 bp，編碼613個氨基酸（圖1-A-a）。利用NCBI中的CD（conserved domain）search對McCOI1a的保守結構域進行預測，結果顯示McCOI1a蛋白的第20-61氨基酸為F-box結構域，第80-126氨基酸為TIR1結構域，是LRR區(qū)域的特定單元，第118-241和310-460氨基酸為AMN1結構域，該結構域共含13條LRR序列（圖1-A-b, c）。采用在線網站ExPASy的ProtParam功能對McCOI1a蛋白理化性質進行分析，結果表明McCOI1a蛋白的MW為68.9 kD，pI為5.93，負電荷的殘基數為77個，正電荷的殘基數為70個，不穩(wěn)定指數47.82（＞40），表明該蛋白屬于不穩(wěn)定類。使用ProtScale功能分析表明McCOI1a為親水性蛋白。信號肽（SignalP-6.0）預測結果表明McCOI1a無信號肽。

圖1 薄荷McCOI1a編碼基因及其蛋白結構分析Fig. 1 McCOI1a gene and its protein structure analysis in M. canadensis

采用SOPMA工具分析McCOI1a蛋白二級結構，結果顯示二級結構中α-螺旋占48.61%，β-轉角占4.73%，延伸鏈占15.33%，隨機卷曲占31.32%（圖1-B）。采用SWISS-MODEL預測McCOI1a蛋白3D結構，結果顯示McCOI1a蛋白與模板序列（3ogl.1.B coronatine-insensitive protein 1）的同一性為69.44%，全局模型質量估計（GMQE）為0.8，α-螺旋為主要結構（圖1-C）。同時，與二級結構預測結果一致，其中紅色為蛋白的配體（N-{（1R, 2S）-3-oxo-2-［（2Z）-pent-2-en-1-yl］}環(huán)乙酰基-L-異亮氨酸，7JA），7JA與模板蛋白的氨基酸殘基通過氫鍵或其他作用力相結合，這些氨基酸殘基一部分在TIR1結構域中，一部分在富亮氨酸重復序列中，都屬于保守氨基酸殘基。

2.2 薄荷McCOI1a蛋白的多序列對比及進化樹分析

為分析McCOI1a與其同源蛋白的氨基酸相似性，利用DNAMAN軟件進行氨基酸序列比對，結果如圖2所示，McCOI1a與AtCOI1（NP_565919.1）、OsCOI1a（XP_015621119.1）、OsCOI1b（XP_0156398-70.1）、OsCOI2（XP_015632448.1）、SiCOI1（XP_011076735.1）、SmCOI1（ARB15806.1）、VvCOI1（AFF57759.1）、SlCOI1（NP_001234464.1）、PaCOI1（XP_021832998.1）、PpCOI1（XP_007220435.1）、IbCOI1-1（AMS24678.1）、IbCOI1-2（AMS24679.1）、CrCOI1（ALI87034.1）、CsCOI1（ANB66331.1）、Hb-COI1（ABV72393.1）、GmCOI1（NP_001238590.1）、MtCOI1（XP_003616569.2）的相似度較高，都具有高度保守的F-box和LRR結構域，并且與丹參Sm-COI1的蛋白同源性最高，為88.69%。利用MEME網站對McCOI1a及其同源蛋白的保守基序進行分析發(fā)現(xiàn)，除丹參SmCOI1、水稻OsCOI2、甘薯Ib-COI1-1含有Motif 15外，所有蛋白都具有14個保守的Motifs，其中，Motif 7是保守的F-box基序，Motif 1是TIR1結構域。Motif 2-6、Motif 8-14為富亮氨酸重復序列，保守基序中亮氨酸的頻率最高（圖3）。進化樹分析表明，McCOI1a與同為唇形科的SmCOI1蛋白聚為一支，同源性最高（圖4），推測McCOI1a可能是薄荷中感受JA信號的受體蛋白。

圖2 McCOI1a與其同源蛋白的氨基酸序列對比Fig. 2 Amino acid sequence comparison of McCOI1a and its homologous proteins

圖3 McCOI1a與其同源蛋白保守基序分析Fig. 3 Analysis of conserved motifs of McCOI1a and its homologous proteins

圖4 薄荷與其它物種中COI1蛋白進化樹分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of COI1 proteins from M.canadensis and other species

2.3 薄荷McCOI1a-GFP融合蛋白亞細胞定位分析

將去除終止密碼子的McCOI1a基因構建至pCAMBIA1302GFP載體上，形成融合表達載體McCOI1a-GFP。將GFP空、McCOI1a-GFP、核定位載體SV40-mcherry分別轉化農桿菌GV3101，隨后將含有不同載體的農桿菌重懸液等比例混合后，通過農桿菌介導的瞬時注射法在煙草葉片中進行瞬時表達。結果如圖5所示，含GFP空載體的煙草葉片細胞在細胞核、細胞膜、細胞質中均觀察到綠色熒光信號，與對照GFP相比，含有McCOI1a-GFP融合載體的煙草葉片細胞僅在細胞核中檢測到綠色熒光信號，且與細胞核定位蛋白的紅色熒光重疊，表明McCOI1a蛋白定位于細胞核中。

圖5 McCOI1a亞細胞定位結果Fig. 5 Subcellular localization results of McCOI1a

2.4 McCOI1a在不同組織、葉序中的表達模式分析

利用RT-qPCR實驗分析McCOI1a在薄荷不同組織以及不同葉序中的表達情況。結果顯示，McCOI1a在薄荷的根、莖、幼葉、老葉、花、蕾、莖尖中廣泛表達，并且在根中表達量最高，莖中表達量最低（圖6-A）。同時，薄荷McCOI1a在不同部位的葉片（葉1-葉8）中均有表達，并且，從薄荷的上部葉到底部葉，McCOI1a表達呈逐漸上升的趨勢（圖6-B），推測McCOI1a可能在薄荷的葉片發(fā)育中具有調控作用。

圖6 McCOI1a在薄荷不同組織及葉序中的表達分析Fig. 6 Expression analysis of McCOI1a gene in different tissues and phyllotaxis of M. canadensis

2.5 McCOI1a在茉莉酸和不同脅迫處理下的表達模式分析

將薄荷進行外源激素MeJA、干旱、NaCl、AlCl3、CdCl2、CuCl2處理，利用RT-qPCR分析McCOI1a在薄荷葉片和根中的表達情況。結果顯示，在MeJA處理下，McCOI1a在葉中的相對表達量在1 h下降，隨后在處理的各時間點呈上調的趨勢，在12 h表達量最高（圖7-A），而在根中，McCOI1a的表達整體呈下降趨勢，在1 h表達最低（圖8-A）。在干旱和AlCl3脅迫處理下，McCOI1a的相對表達量在葉中整體呈逐漸上升的趨勢，在24 h表達量達到最高，分別是對照0 h的3倍和1 206倍（圖7-B,7-D）。在根中，McCOI1a的表達整體呈下降的趨勢，分別在12 h和6 h表達最低（圖8-B, 8-D）。在NaCl處理3 h后，McCOI1a的相對表達量在葉中顯著上調，整體呈先上升后下降的趨勢，在12 h表達量達到最高，是對照0 h的4倍（圖7-C）。在根中，McCOI1a的表達整體呈下降的趨勢，在1 h表達量達到最低（圖8-C）。在CdCl2脅迫處理下，McCOI1a的相對表達量在葉中整體呈先上升后下降的趨勢，在12 h表達量達到最高，是對照0 h的4倍（圖7-E）。在根中，McCOI1a的表達整體呈逐漸下降的趨勢，在24 h表達量最低（圖8-E）。在CuCl2脅迫處理下，McCOI1a的相對表達量在處理的各時間點的葉中顯著上調表達，并呈先升高，再下降，再升高的變化趨勢，在24 h表達量達到最高，為對照0 h的5倍（圖7-F）。在根中，McCOI1a的表達在處理1 h和3 h顯著下調，12 h顯著上調，其余時間點與對照0 h相比，表達差異不顯著（圖8-F）。結果表明，McCOI1a基因對MeJA、干旱、NaCl、AlCl3、CdCl2、CuCl2脅迫處理均有響應。

圖7 茉莉酸和非生物脅迫處理下薄荷McCOI1a基因在葉片中的表達分析Fig. 7 Expression analysis of McCOI1a in the leaves of M. canadensis under MeJA and abiotic stress treatments

3 討論

茉莉酸受體COI1蛋白是植物起始JA信號的關鍵［21-22］。目前，COI1基因已相繼在擬南芥［8］、水稻［23］、小麥［11］、橡膠樹［24］、丹參［16］、長春花［17］等物種中被克隆。本研究從薄荷中克隆得到一條完整的COI1基因，命名為McCOI1a。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，McCOI1a具有典型的F-box和LRR保守結構域，并且，蛋白序列中與7JA配體相結合的氨基酸殘基高度保守，這與其它植物COI蛋白的結構特征一致［6］，表明McCOI1a可能是薄荷中JA的潛在受體蛋白，在JA信號感知中發(fā)揮重要作用。氨基酸相似性以及進化分析發(fā)現(xiàn)，McCOI1a與同科雙子葉植物丹參SmCOI1的同源性最好，親緣關系近，與水稻OsCOIs的同源性較低，親緣關系較遠，推測COI1基因的進化關系在單子葉植物和雙子葉植物之間有明顯的差異。另外，細胞核內的信號轉導對于改變下游基因的表達，增強植物的適應性至關重要［25］，前期研究結果表明，COI1蛋白具有核定位能力，本研究的亞細胞定位結果顯示McCOI1a蛋白定位于細胞核，暗示McCOI1a可能在細胞核內應答JA信號，調節(jié)JA介導的下游基因表達。前期研究表明，燈盞花［26］、水稻［27］、唐菖蒲［28］等不同植物的COI1基因在根、莖、葉和花等不同組織中均有表達，但不同物種間COI1基因在不同組織中的表達有所差異，本研究中薄荷McCOI1a在不同組織中均有表達，而在根中的表達量最高，莖中的表達最低，表明不同植物或同一植物的不同組織中COI1基因的功能可能存在一定差異。

研究發(fā)現(xiàn)，JA在促進葉片衰老中具有重要作用，在擬南芥中，JA通過AtCOI1依賴的方式抑制Rubisco活化酶（RCA）的表達和蛋白豐度促進葉片衰老［29］，而水稻OsCOI1a和OsCOI1b、番茄SlCOI1都是促進葉片衰老所必需的重要調節(jié)因子［10,30］。本研究中，MeJA處理誘導McCOI1a在葉片中上調表達，并且McCOI1a的表達隨著葉片的衰老（從上部葉到下部葉）呈逐漸上升的趨勢，上述研究表明不同物種中COI1蛋白在葉片衰老中的調節(jié)功能具有一定的保守性，而薄荷中JA調節(jié)葉片衰老可能依賴McCOI1a蛋白。另外，JA誘導不同植物中COI1基因差異表達，在沉香（Aquilaria sinensis）中，AsCOI1快速響應MeJA處理，其轉錄水平最高可上調約50倍［31］，在黃花蒿和甘蔗中，MeJA誘導AaCOI1、ShCOI1s基因的表達，但COI1基因表達受JA誘導上調程度較低［13,32］。本研究中，與黃花蒿和甘蔗相似，MeJA誘導薄荷McCOI1a基因表達，且表達上調程度較低，表明不同物種中JA調控COI1基因的表達具有一定的差異。

前人研究表明JA介導的植物對逆境的耐受能力依賴COI1基因。如在鹽脅迫條件下，突變AtCOI1抑制了MeJA處理誘導的氣孔閉合［33］，干旱條件下，MeJA誘導的氣孔閉合同樣依賴COI1介導的JA響應［34-35］。此外，鹽脅迫處理下，擬南芥JAZ基因在根部上調表達依賴于COI1，并且JAZ基因以COI1依賴的方式抑制根的伸長［36］。另外，鋁脅迫處理誘導根尖中AtCOI1上調表達，而突變AtCOI1基因減輕了鋁脅迫處理誘導的根系生長抑制［37］。在小麥中，低溫、高鹽、干旱誘導TaCOI1s基因上調表達［24］。在甘蔗中，ShCOI1s受干旱、低溫處理誘導表達［13］，表明COI1基因表達水平的改變對植物抵抗非生物脅迫的抗性具有重要調控作用。與之前的研究結果相似，干旱、NaCl、AlCl3處理誘導薄荷McCOI1a基因差異表達，表明McCOI1a基因在薄荷抵抗逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。值得注意的是，McCOI1a在葉片中上調表達，在根中下調表達，暗示McCOI1a在薄荷的不同組織中發(fā)揮的功能不同。前期研究發(fā)現(xiàn)，JA處理通過提高活性氧清除系統(tǒng)中抗氧化物酶的活性來增強對植物外源鎘和銅的抗性［38-39］，本研究發(fā)現(xiàn)CdCl2、CuCl2處理顯著誘導薄荷葉片和根中McCOI1a基因的表達，表明McCOI1a可能同樣參與薄荷中鎘和銅脅迫的調控，但有關McCOI1a具體的功能和機制還有待于進一步研究。

4 結論

從薄荷中克隆得到McCOI1a基因，序列全長1 842 bp，編碼613個氨基酸，具有F-box和LRR保守結構域，與其他植物中COI蛋白的結構特征相似；McCOI1a蛋白定位于細胞核，McCOI1a在根中的表達量最高，在薄荷營養(yǎng)生長期的葉序中表達呈上升的趨勢；McCOI1a基因在薄荷的葉片和根中對MeJA、干旱、NaCl、AlCl3、CdCl2、CuCl2均有響應，其中在AlCl3處理的葉片中上調最明顯，最高可達到1 206倍，表明McCOI1a可能在調控薄荷發(fā)育和應答非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。