IFN-γ促進孕期胚胎神經干細胞MHC表達的影響

石 蕊,王玉賢,楊海瀾

近些年來,有多種的研究表明,神經干細胞在胚胎[1]和成年哺乳動物中樞神經系統的不同部位比如脊髓、海馬、紋狀體[2]等都有存在,它是一群具有自我更新和多向分化潛能的細胞,它的發現為人們深入研究中樞神經系統的發育、分化以及探索治療神經系統疾病的新途徑開辟了新的思路。出生后胎兒功能健全的神經系統對于胎兒、家庭和社會都具有極其重要的意義。但是胎兒在母體期間,會受到多種環境因素的影響,例如藥物[3]、病毒[4]、細菌、宮腔感染釋放的各種感染因子[5]等等,這些因素對胎兒身體,尤其是大腦發育可能會造成不可逆的影響。本研究在胚胎神經干細胞體外培養模型的基礎上,檢測γ干擾素(IFN-γ)這一常用炎癥因子對胚胎神經干細胞的影響。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗用孕14 d～16 d Wistar大鼠由上海交通大學醫學院實驗動物中心提供。所有的實驗操作均按照美國國家研究委員會1996年制定的“實驗動物使用和保護指南”和上海交通大學醫學院動物保護和使用委員會制定的“鼠類生存手術指導方針和政策”執行。

1.2 實驗方法

1.2.1 神經干細胞的分離和培養 取孕16 d胚齡的SD大鼠,經乙醚麻醉,常規消毒后取其胚胎,于顯微手術鏡(Lecia)下剝離大腦半球及脊髓組織,分別置于L15培養液(GIBcoBRL公司)中,吹打成細胞懸液。收集細胞懸液過尼龍篩網后,離心并重懸于無血清的神經干細胞基礎培養液DFNG(DMEM/F12培養液、N2、谷氨酰胺,GIBcoBRL公司)中,按1×105/mL密度種瓶,同時添加堿性成纖維生長因子(bFGF,GIBcoBRL公司)和表皮生長因子(EGF,Sigma公司,終濃度均為20 μ g/L),于 5%CO2,37℃細胞培養箱中培養。

1.2.2 神經干細胞的分化 神經干細胞分化實驗時,將分散的單個細胞種于多聚賴氨酸包被的培養蓋玻片上,接種密度為每片種5萬個活細胞。分化培養液為DFNGH添加1%FBS,(fetal bovine serum,GibcoBRL公司),每3 d換液一次。于接種后第6天用于免疫組化染色。IFN-γ處理組的細胞加入IFN-γ(200 U/mL)至分化培養液中孵育。

1.2.3 免疫組化 取切片回復至室溫,10mmol/LPBS(pH 7.4)水化10 min。神經干細胞鑒定時,切片用含0.3%Triton X-100的1×PBS預滲透15min,然后用含10%正常山羊血清或正常驢血清的0.3%Triton X-100-PBS/PBS室溫封閉1 h。加適當稀釋度的一抗4℃孵育過夜。一抗包括:小鼠抗大鼠Nestin單抗(IgG1,BD Pharmingen公司),用于鑒定神經干細胞;兔抗βⅢ-tubulin多抗(Covance Research Products公司),用于鑒定神經元;兔抗GFAP多抗(Sigma公司),用于鑒定星型膠質細胞;小鼠抗 RIP單抗(IgG3,Chemicon公司),用于鑒定少突膠質細胞。切片最后用 PBS洗 3次(每次10 min),然后用含有Hoechst33342(Sigma公司,用于染核)的Gel/Mount aqueous(Biomeda公司)封片后,置 Olympus BX60熒光顯微鏡下鏡檢。

1.2.4 流式細胞術 將經吹打分散的單個細胞重懸于冰浴的PFN(PBS/2%FCS/0.1%Nazide)溶液中,與FITC標記的抗MHC-I類分子抗體(OX-18)或抗MHC-Ⅱ類分子抗體(OX-6,Serotec公司)于4℃孵育30 min。然后細胞用冷的PFN洗兩次,冰丙酮固定10 min后重懸于PFN中立即上FACS Calibur(BD Biosciences,Mountain View,CA)分析。每個樣本分析1萬個細胞。通過前向散射光(FSC)和側向散射光(SSC)設門,去除細胞碎片。

2 結 果

2.1 神經干細胞的鑒定 取孕16 d胚齡的Wistar大鼠,分離其前腦胚胎神經干細胞,在無血清的神經干細胞基礎培養液DFNG中,按1×105/mL密度種瓶,同時添加堿性成纖維生長因子(bFGF)和表皮生長因子(EGF),促使其增殖,經過 3 d～4 d能夠形成較大的神經球,此時可以進行凍存或者傳代。對神經球切片,進行免疫熒光分析表明,90%以上的神經干細胞都是Nestin陽性的細胞。神經干細胞分化實驗時,將分散的單個細胞種于多聚賴氨酸包被的培養蓋玻片上,接種密度為每片種5萬個活細胞。分化培養液為DFNGH添加1%FBS,撤去bFGF和 EGF并且添加FBS,是為了促進分化,每3 d換液1次,于接種后第6天用于免疫組化染色。染色結果表明,體外培養的胚胎神經干細胞能夠分化成β-tubulinⅢ陽性的神經元、Rip陽性的少突膠質細胞和GFAP陽性的星形膠質細胞。

2.2 IFN-γ影響神經干細胞的生長狀態 采用20 U/mL、200 U/mL和2 000 U/mL IFN-γ對神經干細胞進行刺激。在傳代后1 d加入不同濃度的IFN-γ,刺激1 d后,神經干細胞呈現出不同的生長狀態。可以明顯地看出,隨著濃度的增高,神經干細胞逐漸喪失了成球生長的特性,而逐漸貼壁,伸出大量突起;胚胎神經干細胞:從形態上可以發現,沒有加入IFN-γ的神經干細胞保持了強大的增殖能力,但隨著IFN-γ濃度的增加,神經干細胞的增殖能力逐漸減弱,而成球生長的能力喪失,傾向于貼壁生長,伸出較多突起。4倍鏡下。經過3d的培養,發現,2 000 U/mL IFN-γ的濃度對神經干細胞生長有明顯的毒性作用。培養瓶中細胞大量死亡,而其他濃度細胞未見明顯死亡。接著,取 4種 IFN-γ刺激濃度(0、20 U/mL、200 U/mL、2 000 U/mL)的細胞上清進行LDH毒性測試,也證實了這個結論。

2.3 IFN-γ促進神經干細胞MHC分子的表達 采用流式細胞術,針對大鼠M HCⅠ類和Ⅱ類分子的相應抗體OX-18和OX-6,對刺激2 d的神經干細胞進行檢測。結果發現,體外培養的神經干細胞既表達MHCⅠ類分子,也表達M HCⅡ類分子,但表達量很低。但是,經過炎性因子IFN-γ刺激以后,神經干細胞MHCⅠ類和Ⅱ類分子的表達顯著上調。

3 討 論

在孕期胎兒神經系統的發育是胎兒發育中重要的一環,在這個過程中胎兒生長環境的任何變化,都可能導致胎兒發育的異常。神經干細胞是神經發育的起始細胞,由干細胞發育而來,具有自我復制和多向分化的潛能,能夠分化成神經元,少突膠質細胞和星形膠質細胞,是神經發育的重要細胞。IFN-γ是一種重要的炎性介質,在病毒感染,細菌感染等疾病中大量分泌,但是IFN-γ是否會影響神經干細胞的生長狀態,對神經干細胞有怎樣的影響呢?

在本研究中,建立了大鼠神經干細胞體外培養模型,在此基礎上發現,IFN-γ在高濃度情況下,對神經干細胞具有顯著的毒性作用,在中等劑量下,會促進孕期胚胎神經干細胞的MHC的表達。由于MHC作為主要組織相容性抗原,在器官排斥中起重要作用,它的表達上調,推測IFN-γ可能在胎兒發育過程中起到非常重要的作用。大劑量IFN-γ對神經干細胞具有毒性作用,其毒性具有劑量依賴作用,提示嚴重的感染或者疾病,產生的炎性因子可能直接對胎兒產生不利影響。

關于神經干細胞是否表達MHC分子,近些年才有一些報道,但是由于采用的種屬和細胞培養方法不同,結果也有一些不同。McLaren[6]報道大鼠的神經干細胞低水平,表達了MHCⅠ類分子但不表達M HCⅡ類分子,而Sun等[7]發現,IFN-γ能夠在早期妊娠增加非經典的MHCⅡ類抗原RT1-DM和經典的MHC I類抗原RT1-A的表達,而在妊娠中期降低它們的表達。在晚期妊娠,胎盤RT1-A的表達降低,在子宮中升高,而RT1-DM在子宮和胎盤中都升高。本研究結果顯示,正常細胞培養情況下,大鼠的神經干細胞低水平的表達MHC抗原,但是IFN-γ能夠顯著上調其表達。MHC作為一種主要的移植抗原,表達的上調意味著胎兒被排斥風險的增加,以及神經系統發育障礙的機會增大。從另外一方面講,MHC是否參與神經系統發育過程,也是值得關注的一個問題。

[1]Smith AG.Embryo-derived stem cells:Of mice and men[J].Annu Rev Cell Dev Biol,2001,17:435-462.

[2]Conti L,Reitano E,Cattaneo E.Neural stem cell systems:Diversities and properties after transplantation in animal models of diseases[J].Brain Pathol,2006,16:143-154.

[3]Tatum WO.Balancing the risks to the fetus from epileptic seizures and antiepileptic drug exposure in pregnancy[J].Expert Rev Neurother,2009,9:1707-1708.

[4]黃星,蔣艷敏,秦雪,等.乙肝病毒宮內感染與臍血 Th1/Th2細胞亞群體外活化的研究[J].中國婦幼保健,2007,22(10):1398-1399.

[5]毛會軍,胡雪梅,張群,等.早孕期弓形蟲感染對大鼠胎盤IL-4、IL-10和IFN-γ表達水平的影響[J].現代免疫學,2007,27(5):386-391.

[6]McLaren FH,Svendsen CN.Analysis of neural stem cells by flow cytometry cellular differen-tiation modifies patterns of M HC expression[J].J Neuroimmunol,2001,112(1-2):35-46.

[7]Sun Q H,Peng JP,Xia HF,et al.Effect on ex pression of RT1-A and RT 1-DM molecules of treatme-nt with interferon-gamma at the maternal-fetal interface of pregnant rats[J].Hum Reprod,2005,20(9):2639-2647.