毛細管電色譜的研究進展及其在藥物分析中的應用

王倩如

(南京市婦幼保健院,江蘇南京 210004)

毛細管電色譜 (capillary electrochromatography,CEC)是近年來發展十分迅速的一種新型分離技術。它是將常規色譜填料填充到毛細管中,或在毛細管內表面鍵合、涂敷固定相,以電滲流(EOF)作為流動相的推動力,根據樣品中各組分在固定相和流動相間分配系數的差異和在電場中遷移速率的不同而實現分離的一種高效微分離技術。近年來,隨著 CEC柱制備技術、分離機制、儀器設備的不斷研究和發展,CEC已在分析領域中引起廣泛關注,并在有機小分子分離、環境分析、藥物分析和生化分析等方面得到應用。本文就 CEC的研究進展、CEC整體柱制備新進展及其在藥物分析中的應用作一概述。

1 研究進展

毛細管電色譜的發展可追溯到20世紀50年代,Mould和Synge將電場應用到薄層液相色譜中進行寡糖分離,1974年,Pretorius等[1]首次將電場引入到高效液相色譜中,顯示出以電滲流(electroosmotic flow,簡稱 EOF)作為流動相推動力進行分離的巨大優勢,但他們的文章在當時并未引起足夠的關注。

1990年,Tusda等人發展了毛細管電色譜連續進樣技術,利用柱系統中同時存在的壓力流和電滲流對柱內樣品進行了富集和分離。1995年,Guo等人首次利用溶膠-凝膠技術制備了開管毛細管電色譜柱。Lord等人發展了毛細管電色譜與質譜聯用技術,并將其應用于染料分析中。1998年,Stead等人發展了毛細管電色譜柱上濃縮技術,并用于血漿中甾類化合物的分析。Bayer等人首次實現了毛細管電色譜與核磁共振的聯用。次年,Horvath等人進一步發展了毛細管電色譜的動力學理論,對毛細管電色譜和高效液相色譜中影響柱效的各種參數進行了比較研究。Poppe等人研究了填料孔結構對毛細管電色譜柱性能的影響。

近年來,國內外有關 CEC的分離機制、柱制備、應用研究以及全面的綜述文章迅速增加,且隨著電色譜基本理論的進一步完善,電色譜在生化藥物的分析、制藥工業、手性藥物拆分等領域得到廣泛應用。表明在分析領域中已出現毛細管電色譜這一新的研究熱點。

2 CEC整體柱制備新進展

毛細管電色譜柱在 CEC分離體系中占據最重要的地位,它具有雙重作用：一是作為固定相,承擔對分離對象的分離任務;二是在其表面形成雙電層,在電場作用下產生電滲流,作為推動力。CEC分離柱主要分為三種類型：填充柱、開管柱和整體柱。由于篇幅所限,本文主要針對 CEC整體柱制備新進展進行介紹。

CEC整體柱可分為有機聚合物型和硅基型兩大類。

2.1 聚合物型整體柱

有機聚合物型整體柱是由單體和交聯劑在有致孔劑的存在下,在毛細管內由自由基引發原位聚合而得。聚合物型整體柱具有制備簡單,重現性好,柱效高及分離快速等優點,已在多種色譜模式下獲得了成功的應用。

Ye等[2]采用甲基丙烯酸縮水甘油酯(GM A)和亞乙基二甲基丙烯酸酯(EDM A)聚合制備了中性的聚合物整體柱,然后在聚合物表面修飾了一層胰島素用于在線消化蛋白質。Dong等[3]借鑒了 Ye等制備聚合物整體柱的方法,采用兩性的賴氨酸修飾于柱表面,成功地應用于 CEC分離。這種整體柱的特點在于柱內電滲流方向可以隨 pH值的變化而變化,使得分離過程中多了一個調控分離度的參數。

2.2 硅基整體柱

由于 Tanaka研究小組[4]在硅膠整體柱制備方面的出色工作,使得這類整體柱的研究日益受到重視。

Ye等[5]制備了一種苯基氨丙基修飾的硅膠整體柱。他們首先采用 Tanaka研究小組開發的經典制柱技術制備了硅膠整體柱,然后將3一苯基氨丙基三甲氧基硅烷溶液引入柱內,于110℃下反應 lh。與 C18修飾的普通反相柱相比,這種苯基氨丙基修飾的硅膠整體柱在 CEC模式下分離苯胺類的堿性化合物時拖尾很小。

Xie等[6]在制備獲得了硅膠整體柱后,采用3-巰基丙基三甲氧基硅烷(3-M PS)修飾整體柱,接著原位鍵合并氧化巰基為磺酸基團 ,獲得了強陽離子交換 (SCX)固定相,用來分離一受體阻滯劑和生物堿取得了210,000至340,000理論塔板 /米的高分離效率。

3 在藥物分析中的應用

盡管毛細管電色譜(CEC)技術的發展歷史并不長,但作為一個新興的分離分析技術,其研究和發展的生命力最終必將體現在解決一些實際樣品分離分析時所具有的優越性,因此,CEC技術發展到一定的階段后必定會伴隨著大量的實際應用,其結果又將促進 CEC技術的研究和開發。本文將從已有的大量文獻報道中篩選出一些比較有代表性的應用實例進行介紹。

3.1 在手性拆分中的應用

CEC進行手性藥物對映體拆分主要有三種方式：(1)非手性固定相結合手性添加劑流動相,手性選擇作用依靠流動相中添加的手性選擇劑產生。(2)手性固定相,固定相上鍵合手性選擇劑,如環糊精、蛋白等。(3)手性分子烙印固定相,進行記憶性、專一性手性分離。Wiedmer等[7]使用 BSA和溶菌酶固定的磷脂涂敷毛細管分離 D型和 L-型色氨酸,L-色氨酸的理論塔板數超過500000m-1,而 D-色氨酸的理論塔板數只用大約22,000m-1,且固定化的 BSA的對映體手性選擇性比固定化溶菌酶高。

3.2 CEC在傳統中藥復雜成分中的應用

隨著毛細管電色譜的出現及推廣,為中藥有效成分的分離分析提供了新方法和新手段。如李海燕等[8]運用膠柬電動毛細管色譜法同時分離測定了水中鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸丁芐酯、鄰苯二甲酸二辛酯五種鄰苯二甲酸酯的標準混合物。結果表明,30 min內五種鄰苯二甲酸酯得到了較好的分離。廖杰等[9]使用反相毛細管電色譜分離蟬翼藤山酮類化合物,并對色譜分離條件進行優化研究。

3.3 CEC在生物大分子中的應用

不少研究工作者開始將研究方向轉移到 CEC分離分析生物大分子。如 Bandilla等[10]使用整體柱毛細管電色譜分離模型蛋白,并表明了蛋白質容量因子隨流動相中有機溶劑的增加而增加 ,且獲得了高分辨率。Lin等[11]使用整體柱毛細管電色譜分離寡肽(包括血管緊張素Ⅰ、血管緊張素Ⅱ、Sar11、Thr8血管緊縮素、催產素、抗利尿激素系、牛 β-酪蛋白的肽能片段、人 β-酪蛋白的肽能片段和 FMRF酰胺),并比較了模板聚合物和無模板聚合物的分離行為,指出這些寡肽的電色譜分離由電泳遷移和色譜保留介導。Asthana等[12]使用膠體聚合(N-異丙基酰胺)顆粒作為假固定相的毛細管電色譜進行 DN A突變分析,指出基于聚合(N-異丙基酰胺)的毛細管電色譜有較窄的大小分布。

3.4 CEC在環境分析中的應用

由于化學合成工業的發展和天然化合物的開發,使得環境污染越來越嚴重。據報道,被確認為環境污染物的已超過350種。因此,環境污染物的檢測和監控已成為分析化學中重要的研究課題之一,CEC技術已開始被應用于環境污染物的分析。如李海燕等[13]采用膠束電動毛細管電泳法同時分離測定了水中鄰苯二甲酸二甲酯(DM P)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二辛酯(DOP)五種化合物。并采集實際生產廢水樣,運用該法測定了其中 BBP的含量。呂海霞等[14]以整體固定相作為分析柱,結合加壓毛細管電色譜一紫外檢測同時分離馬拉硫磷、二嗪農、甲基對硫磷、殺螟硫磷、倍硫磷、甲基毒死蜱和毒死蜱等7種有機磷類化合物。考察了等度洗脫條件下,流動相乙腈配比、緩沖液濃度、酸度及分離電壓的影響,建立了最優色譜分離條件。Ye等[15]使用加壓毛細管電色譜分離六種合成除蟲菊酯農藥殘留物,且考察了緩沖液PH、有機溶劑含量、緩沖液濃度和應用電壓在六種合成除蟲菊酯分離上的效應。

4 展望

毛細管電色譜已廣泛應用到氨基酸、蛋白質、手性藥物、環境樣品等多種樣品的分析。無論是填充柱、開管柱還是發展勢頭較快的整體柱,都具有其自身的優勢。隨著柱制備技術的改進,電色譜柱也將不斷地得到完善和發展,電色譜技術必將擁有廣闊的應用前景和光明的未來。

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