血清HPLC指紋圖譜法研究芍藥甘草湯伍用的合理性

陳梅，姚楠，周秋香，3，黃衛華，3，李友賓#

（1.南京中醫藥大學，南京市 210046；2.江蘇省中醫藥研究院中藥化學室，南京市 210028；3.中國藥科大學，南京市 210009）

芍藥甘草湯源于醫圣張仲景的《傷寒論·太陽篇》，為解痙、緩急止痛的經典古方，由芍藥和甘草等份組成。藥雖兩味，但結構嚴謹，配伍精當。白芍藥味苦酸、性微寒，入肝脾兩經，功專養血斂陰、柔肝止痛，癥見脘腹諸痛、四肢攣急等證候。甘草性味甘平，入十二經，炙用益氣補血、緩急止痛。兩藥相伍，其效倍增。本方已廣泛應用于臨床各科，其藥理作用主要集中在解痙、鎮痛鎮靜及抗炎方面。

“血清藥理學”和“血清藥物化學”概念的提出，使人們漸漸認識到中藥中的眾多成分只有被吸收入血者才能產生作用，血中含有的成分才可能是中藥體內直接作用物質。中藥的藥效物質基礎應在給藥后的血清組成中進行探討，對進入血清的成分進行研究，能在相對有限的成分中探明與復方效應相關的藥效物質基礎[1]。因此，可通過比較單味藥、復方水煎液與單味藥、復方含藥血清HPLC指紋圖譜，確定單味藥和組成復方后入血成分“數”與“量”的變化，從而探討芍藥與甘草伍用的合理性。

1 材料

1.1 儀器

Waters Alliance高效液相色譜（HPLC）系統，包括Empower色譜工作站（美國Waters公司）；AT-201型十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；R-200型旋轉蒸發儀（瑞士步琪公司）；Coulter Allegra 64R型多功能臺式高速離心機（美國Beckman公司）；渦旋混合器（江蘇省金壇市醫療儀器廠）；Milli-PORE純水器（美國密理博公司）。

1.2 試藥

炙甘草（批號：080919）、白芍（批號：080919）購自上海藥房股份有限公司亳州徐重道中藥飲片廠，經江蘇省中醫藥研究院中藥化學室李友賓研究員鑒定為真品；甘草酸（批號：ZL200806010）、甘草次酸（批號：ZL0807010A）購自南京澤朗醫藥科技有限公司；甘草酸二鉀對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100551-200401）；乙腈（色譜純，德國 Merck公司）；甲醇（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）；三氟乙酸（分析純，上海天蓮精細化工有限公司）；甘草苷、甘草素、異甘草素、新甘草苷、芒柄花苷、異芒柄花苷、白芍苷、芍藥苷、苯甲酸、4″-羥基白芍苷標準品為筆者自制（純度＞99%）；水為Milli-PORE純水器凈化水。

1.3 動物

健康SD大鼠24只，♂，體質量（200±20）g，由江蘇省中醫藥研究院實驗動物中心提供（動物生產許可證號：SCXK（滬）2008-0005）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：AlltimaTMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.05%三氟乙酸水溶液（B），二元梯度系統（洗脫程序：0～5 min，15%A；5～10 min，15%A→20%A；10～17 min，20%A；17～30 min，20%A→25%A；30～42 min，25%A；42～85 min，25%A→40%A；85～105 min，40%A→50%A；105～125 min，50%A→82%A；125～150 min，82A%）；檢測波長：232 nm；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取白芍、炙甘草藥材各72 g，于10倍量蒸餾水中浸泡30 min，加熱煮沸10 min，轉文火煮1 h，趁熱過濾。藥渣繼續加8倍量蒸餾水加熱煮沸10 min，轉文火煮1 h。合并2次煎出液，濃縮，定容至1 mL含生藥1.44 g的芍藥甘草湯水煎液，供灌胃和分析用。另取白芍、炙甘草各72 g，同法單煎、濃縮，配制成每1 mL含生藥0.72 g的白芍水煎液與炙甘草水煎液，供灌胃和分析用。取上述藥液各0.1 mL，置于10 mL量瓶中，蒸餾水定容，進樣前0.45 μm微孔濾膜濾過。

2.3 對照品溶液的制備

取對照（標準）品甘草酸、甘草酸二鉀、甘草次酸、甘草苷、甘草素、新甘草苷、芒柄花苷、異芒柄花苷、白芍苷、芍藥苷、苯甲酸、4″-羥基白芍苷各1 mg，精密稱定，加甲醇配制成一定濃度的對照品溶液，進樣前0.45 μm微孔濾膜濾過。

2.4 受試大鼠給藥方案

取SD大鼠24只，禁食過夜15 h（自由飲水），于次日早晨隨機分成4組，即空白、白芍、甘草、芍藥甘草湯組。ig給藥（20 mL·kg-1），連續3次，每次間隔1 h，于末次給藥后45 min眼底靜脈叢取血。室溫靜置0.5 h，4000 r·min-1離心20 min，分離出血清冷凍（－20℃）至分析。

2.5 血清樣品的制備

取待測血清1.5 mL，置于10 mL離心管中，加6 mL甲醇沉淀蛋白，渦旋振蕩3 min，6000 r·min-1離心20 min去除蛋白質，取上清液5 mL，于40℃水浴上N2吹干，殘渣加0.1 mL甲醇溶解，振蕩2 min，進樣前0.45 μm微孔濾膜過濾，供HPLC檢測分析。

2.6 色譜條件的選擇及優化

為了獲得分離度好、靈敏性高以及檢測峰數量盡可能多的色譜，對以下色譜條件及參數進行了選擇及優化：流動相的組成、檢測波長、流速以及運行時間。芍藥甘草湯中主要含有黃酮類、皂苷類、單萜苷類、有機酸類等，這些化合物類群的極性差別很大，只能用梯度洗脫。根據文獻[2]，用乙腈和0.05%三氟乙酸水溶液組成的流動相進行梯度洗脫，結果得不到比較好的色譜。因而對梯度洗脫程序進行優化，選擇乙腈和0.05%三氟乙酸水溶液梯度系統，流速最終確定為0.8 mL·min-1，檢測波長為232 nm，運行時間為150 min。通過色譜條件的優化，得到的流動相系統和洗脫程序獲得了較多的峰及較好的峰形。經200～400 nm全波長掃描檢測，白芍、甘草及芍藥甘草湯水煎液樣品在上述優化的色譜條件下分離較好。單、復方水煎液樣品的色譜見圖1。

圖1 單、復方水煎液樣品的HPLCa.白芍水煎液；b.甘草水煎液；c.芍藥甘草湯水煎液；21.白芍苷；25.芍藥苷；30.新甘草苷；31.甘草苷；38.苯甲酸；41（.異）芒柄花苷；44（.異）甘草素；51.甘草酸；56.4″-羥基白芍苷Fig 1 HPLC fingerprint of decoctionsa.P.lactiflora decoction；b.G.uralensis decoction；c.Shaoyao gancao decoction；21.albiflorin；25.paeoniflorin；30.neoliquiritin；31.liquiritin；38.benzoic acid；41.（iso）ononin；44.（iso）liquirtigenin；51.glycyrrhizic acid；56.4″-hydroxyl-albiflorin

2.7 采血時間點的考察

取9只大鼠ig芍藥甘草湯水煎液后9個時間點的血清樣品，進行HPLC分析檢測。由大鼠重復ig芍藥甘草湯水煎液后不同時間點血清樣品色譜圖可見，重復給藥后不同時間點色譜峰差異較小，說明重復多次給藥有利于各成分保持穩定的血藥濃度，避免了因單次給藥不同類群化合物吸收速度不同所造成的影響。通過比較發現，45 min血清樣品圖譜中色譜峰峰數較多，峰值較高，故選擇芍藥甘草湯水煎液重復多次ig后45 min采血。色譜見圖2。

圖2 芍藥甘草湯水煎液給藥后不同時間點血清樣品的HPLCa.空白血清；b.15 min；c.30 min；d.45 min；e.60 min；f.90 min；g.120 min；h.240 min；i.300 min；j.360 minFig 2 HPLC fingerprints of Shaoyao gancao decoction at different administration timea.blank serum；b.15 min；c.30 min；d.45 min；e.60 min；f.90 min；g.120 min；h.240 min；i.300 min；j.360 min

2.8 方法有效性考察

為保證建立芍藥甘草湯水煎液指紋圖譜及大鼠給藥后血清藥物化學動態指紋圖譜方法的穩定性、精密度、重復性，筆者對方法的有效性進行了考察。方法的精密度通過分析考察45 min血清樣品，測定日內、日間各共有峰的相對保留時間（RRT）和相對峰面積（RPA）的相對標準偏差（RSD），其RSD分別＜5%和＜15%（n＝5）。方法的重復性通過對同組6份大鼠ig芍藥甘草湯水煎液后45 min血清樣品RRT和RPA的RSD進行考察，其RSD分別＜3%和＜40%（n＝6）。方法的穩定性主要考察了血清樣品的穩定性，血清樣品被冷凍0、24、48、72 h后解凍處理進行分析，其RRT和RPA的RSD分別＜5%和＜10%。以上數據可確保我們建立藥材水煎液指紋圖譜及血清藥物化學動態指紋圖譜方法的有效性。芍藥甘草湯含藥血清樣品的精密度、重復性及穩定性試驗結果見表1。

2.9 血清HPLC指紋圖譜分析

對大鼠重復多次ig給藥后45 min血清樣品圖譜進行色譜指紋圖譜相似度分析，獲得其共有峰。根據其相應的紫外光譜數據，與空白血清HPLC圖譜色譜峰比較，芍藥甘草湯給藥后血清樣品有32個血中移行組分（SGT1～SGT32），其中17個為原方直接入血成分，15個為代謝產物。白芍水煎液給藥后血清樣品有8個入血成分（S1～S8）；甘草水煎液給藥后血清樣品有23個血中移行成分（G1～G23）。復方入血成分SGT1、SGT2、SGT6、SGT7、SGT14、SGT16、SGT20、SGT26來源于白芍血中移行成分 S1～S8，其中 SGT1、SGT2、SGT6、SGT7、SGT14為白芍所含成分直接入血形成；復方入血成分SGT2、SGT3、SGT4、SGT5、SGT8、SGT9、SGT10、SGT11、SGT13、SGT15、SGT17、SGT18、SGT19、SGT21、SGT22、SGT24、SGT 25、SGT27、SGT28、SGT29、SGT30、SGT31、SGT32 來源于甘草血中移行成分G1～G23，其中SGT2、SGT3、SGT4、SGT8、SGT9、SGT10、SGT11、SGT15、SGT17、SGT18、SGT21、SGT 25、SGT29為甘草所含成分直接入血形成，SGT2為白芍、甘草共同含有的物質入血而成；復方給藥后血清中產生了單煎液給藥后未出現的新物質SGT12與SGT23。經與對照品比較，SGT6、SGT7分別為白芍苷、芍藥苷；SGT10、SGT11、SGT29、SGT32分別為新甘草苷、甘草苷、甘草酸和甘草次酸。復方配伍與單味生藥相比，其入血成分存在差異。因此，在研究復方藥物的作用物質基礎時，不能直接以單味藥血中移行成分的簡單加和來代替全方，而應該充分考慮到配伍后化學成分間的相互作用。

表1 芍藥甘草湯含藥血清樣品的精密度、重復性及穩定性試驗結果Tab 1 Results of precision，repeatability and stability of serum samples of Shaoyao gancao decoction

由白芍水煎液、甘草水煎液及芍藥甘草湯水煎液給藥后血清樣品HPLC可見，相較單方水煎液給藥后血清樣品，大鼠ig芍藥甘草湯復方水煎液后吸收入血的成分明顯增多。白芍單方水煎液ig后入血成分含量較低，但配伍甘草后，SGT6（白芍苷）、SGT7（芍藥苷）、SGT14、SGT16、SGT26峰面積則明顯增加；復方血清樣品中SGT10（新甘草苷）、SGT11（甘草苷）、SGT15、SGT17、SGT18、SGT24、SGT25、SGT27、SGT28、SGT29（甘草酸）、SGT32（甘草次酸）峰面積也相應較甘草單方水煎液血清樣品高。

3 討論

有文獻[3]報道，以甘草的甲醇提取物FM100（主成分為甘草酸及多種甘草黃酮）代表甘草，芍藥苷代表芍藥，對本方的藥理作用進行研究，發現二者并用在鎮痛方面有明顯的協同作用。木村正康[4]用芍藥、甘草的提取物芍藥苷和甘草皂苷研究本方對骨骼肌的松弛作用，結果表明以單味作用不明顯的濃度將芍藥苷和甘草皂苷按4∶1的克分子比相互組合，可對神經肌肉接合部位呈阻斷作用；將單用呈現作用濃度的芍藥苷和單用不呈作用濃度的1/4量的甘草皂苷共存，可使芍藥苷的反應增強2倍左右，提示本方對骨骼肌的松弛作用較單味藥強。Kimura M等[5]發現，芍藥苷與甘草酸同用時可以間接阻斷因刺激引起的顫搐，而在相同濃度情況下兩者單用時無阻斷作用。也有學者[6]研究發現，芍藥苷和甘草酸對小鼠神經刺激的骨骼肌細胞內Ca2+的流通具有互補作用，從而阻斷神經肌肉傳遞，緩解肌肉疼痛。可見，芍藥、甘草效應組分（芍藥苷、甘草黃酮、甘草酸部位）是芍藥甘草湯解痙、鎮痛、鎮靜作用的有效部位[7]。

有學者[8]發現，甘草總苷和白芍總苷的抗炎鎮痛作用明顯弱于本方總苷。可見，本方組成成分甘草總苷和白芍總苷具有一定的協同效應。另有學者[9]通過動物實驗研究發現，全方作用貢獻度為芍藥＞甘草，兩藥之間具有協同作用。經拆方研究[10]發現，本方對小鼠胃排空功能可出現較甘草單獨使用時更為明顯的抑制作用，芍藥可加強其對胃排空的抑制作用。

此外，通過藥動學研究發現，大鼠分別灌胃給予本方和單味甘草湯后，本方中甘草酸和甘草次酸的血藥濃度、生物利用度顯著增高[11]。另有研究[12]表明，口服芍藥苷的生物利用度是很低的，但是甘草能有效增強芍藥苷的吸收，提高其在血液中的濃度；與單獨口服芍藥提取物后芍藥苷的動力學參數相比，口服本方后芍藥苷的吸收明顯增強。藥動學研究結果表明，本方在臨床應用中具有藥理學上的協同作用。

本文采用血清HPLC指紋圖譜法研究芍藥甘草湯伍用的合理性，由單方及芍藥甘草湯復方血清指紋圖譜可見，因為與甘草配伍，使芍藥效應組分白芍苷、芍藥苷等更多地吸收進入血液，提高其生物利用度；甘草與芍藥伍用后，其效應組分甘草苷、新甘草苷、甘草酸、甘草次酸等的入血峰面積明顯較甘草單方水煎液血清樣品增加，可見甘草的生物利用度也明顯提高。綜上，兩者伍用存在相互協同的作用，這和其他研究方法得出的結論一致，但比其他方法簡便直觀，從另一個角度驗證了本方組方配伍的科學合理性。

[1]Xijun Wang，Wenjun Sun，Hui Sun，et al.Analysis of the constituents in the rat plasma after oral administration of Yin Chen Hao Tang by UPLC/Q-TOF-MS/MS[J].J Pharmaceut Biomed，2008，46（3）：477.

[2]張 梁，徐德生，馮 怡.芍藥甘草復方大鼠血中移行組分歸屬分析研究[J].中國中藥雜志，2007，32（17）：1789.

[3]Keijiro T，Masatoshi H.Pharmacological studies on herb paeony rootⅠ.Central effects of paeoniflorin and combined effects with licorice component FM100[J].Yakugaku zasshi，1969，89（7）：879.

[4]木村正康.芍藥甘草湯對骨骼肌松弛作用的機制[J].國外醫學-中醫中藥分冊，1983，5（6）：21.

[5]Kimura M，Kimura I，Takahashi K，et al.Blocking effects of blended paeoniflorin or its related compounds with glycyrrhizin on neuromuscular junctions in frog and mouse[J].Jpn J Pharmacol，1984，36（3）：275.

[6]Katsuya D，Ikuko K，Kayoko M，et al.Complementary effects of Paeoniflorin and Glycyrrhizin on intracellular Ca2+mobilization in the nerve-stimulated skeletal muscle of mice[J].Jpn J Pharmacol，1995，69（3）：281.

[7]郝 飛.甘草酸國外研究進展[J].中國藥房，2001，12（8）：501.

[8]劉陶世，趙新慧，段金廒，等.芍藥甘草湯總苷抗炎鎮痛作用的配伍研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2007，18（6）：427.

[9]鐘志勇，龔奧娣，韓 堅，等.用多指標正交設計合并線性回歸法探討芍藥甘草湯的最佳配比[J].中藥藥理與臨床，2005，21（6）：7.

[10]李 巖，陳蘇寧，李宇權，等.芍藥甘草湯、四逆散對胃排空及小腸推進功能影響的拆方研究[J].中國消化雜志，1996，16（1）：18.

[11]項 琪，程 剛，陳濟民.芍藥甘草湯在大鼠體內藥代動力學研究[J].中國藥學雜志，2000，35（9）：615.

[12]Lih-Chi Chen，Mei-Huei Chou，Ming-Fang Lin，et al.Pharmacokinetics of Paeoniflorin after oral administration of Shao-yao Gan-chao Tang in mice[J].Jpn J Pharmacol，2002，88（3）：250.