HPLC法同時測定復方紫草顆粒中咖啡酸四聚體和丹酚酸B的含量

秦冬梅，買爾旦·馬合木提，賀金華

（1.石河子大學藥學院，石河子市 832002；2.新疆醫科大學附屬腫瘤醫院，烏魯木齊市 830000；3.新疆維吾爾自治區藥物研究所，烏魯木齊市 830004）

復方紫草顆粒由紫草、丹參等4味藥組成，具有抗病毒、增強機體免疫及抗人免疫缺陷病毒（HIV）-1體外活性[1～3]之功效。咖啡酸四聚體、丹酚酸B是復方紫草顆粒的代表性活性成分，但在2005年版《中國藥典》中未收載紫草中咖啡酸四聚體的含量測定方法，目前也尚未見到同時測定復方紫草顆粒中咖啡酸四聚體、丹酚酸B含量的報道。復方中藥藥效的發揮是多組分共同作用的結果，各指標成分的含量及其比例均會影響藥效。為了更好地評價復方紫草顆粒的質量，筆者建立了高效液相色譜（HPLC）法同時測定復方紫草顆粒中咖啡酸四聚體和丹酚酸B的含量，該方法專屬性強，準確、快速，可為復方紫草顆粒的質量控制提供新的分析手段。

1 儀器與試藥

Series 2000型HPLC型儀（美國PerkinElmer公司）；DKS26型電熱恒溫水浴鍋（上海精密實驗設備有限公司）；RE-52A型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；單盤光電分析天平（北京光學儀器廠）。

試驗用植物購于新疆參茸藥業有限公司，品種鑒定由新疆醫科大學藥學院生藥/天然藥物化學教研室完成；丹酚酸B對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：11562-200705）；咖啡酸四聚體標準品（筆者自制，純度：98.11%，其1H-NMR、13C-NMR、UV、IR和ESI-MS數據與文獻[4,5]對照一致）；甲醇為色譜純，水為重蒸水，磷酸、乙醇為分析醇；復方紫草顆粒由筆者自制（處方由紫草、丹參、黃芪、紅參4味藥組成）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：YMC-Pack ODS-A C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-0.5%磷酸水（40∶60）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：252 nm；柱溫：室溫；進樣量：10 μL；外標法定量。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照（標準）品溶液：精密稱取咖啡酸四聚體標準品適量，用水定容制成含咖啡酸四聚體0.1300 mg·mL-1的標準品溶液；精密稱取丹酚酸B對照品適量，用水定容制成含丹酚酸B 0.4100mg·mL-1的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液：取本品研細，精密稱取適量（約1 g），置于棕色具塞錐形瓶中，加水25 mL，密塞，超聲提取30 min，放冷至室溫，過微孔濾膜（0.45μm），即得。

2.2.3 陰性對照溶液：按處方分別制備不含紫草、丹參的陰性顆粒，并按“2.1.2”項下方法制備陰性對照溶液，備用。

2.3 線性關系考察

精密稱取咖啡酸四聚體標準品1.3 mg、丹酚酸B對照品4.1 mg，用水定容至10 mL；分別取2種溶液0.5、2、5、8、10、14μL，在上述色譜條件下進樣，記錄色譜圖。以峰面積積分值（A）對進樣量（X，μg）進行線性回歸，得咖啡酸四聚體、丹酚酸B的回歸方程分別為A＝796693X－16249（r＝0.9996）、A＝839545X－52450（r＝0.9997）。結果表明，咖啡酸四聚體、丹酚酸B的進樣量分別在0.065～1.82、0.205～5.74 μg范圍內與各自的峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.4 系統適用性試驗

在上述色譜條件下，咖啡酸四聚體、丹酚酸B和供試品中其它組分色譜峰可達基線分離，理論塔板數應不低于6000，分離度＞1.5。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C、D.陰性對照；1.咖啡酸四聚體；2.丹酚酸BFig1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C，D.negative control；1.caffeic acid tetramers cat；2.salnianolic acid B

2.5 精密度試驗

精密吸取0.0752 mg·mL-1的咖啡酸四聚體標準品溶液、0.0956 mg·mL-1的丹酚酸B對照品溶液10μL，在上述色譜條件下連續進樣5次。結果，咖啡酸四聚體和丹酚酸B峰面積積分值的RSD分別為0.87%和0.43%，表明儀器精密度好。

2.6 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別在0、2、4、6、8、10 h進樣，測定。結果表明，供試品溶液在10 h內穩定性良好，咖啡酸四聚體、丹酚酸B的RSD分別為4.91%、1.82%。

2.7 重復性試驗

取同一批樣品，分別制備6份供試品溶液，測峰面積，并計算咖啡酸四聚體、丹酚酸B的含量，進樣量為10μL。結果，咖啡酸四聚體、丹酚酸B的平均含量分別為0.0179、0.088 mg·mL-1，RSD分別為2.31%、1.71%，表明方法重復性好。

2.8 專屬性考察

分別取對照（標準）品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液注入色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進樣。結果，供試品中咖啡酸四聚體、丹酚酸B與相鄰成分分離度良好；陰性對照溶液在與咖啡酸四聚體、丹酚酸B對照品相同位置上未見相同色譜峰，表明陰性對照無干擾。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的提取液9份，每份5 mL，分別精密加入低、中、高濃度的咖啡酸四聚體標準品、丹酚酸B對照品溶液2 mL各3份，按“2.1.2”項下方法制成供試品溶液，按上述色譜條件測定咖啡酸四聚體、丹酚酸B的含量，計算回收率。結果，咖啡酸四聚體、丹酚酸B的平均回收率分別為98.72%、101.39%，RSD分別為3.27%、1.81%。

2.10 樣品含量測定

按“2.1.2”項下方法操作，分別精密吸取供試品溶液與對照品溶液各10μL，注入液相色譜儀，以外標法計算樣品中咖啡酸四聚體、丹酚酸B的含量，結果見表1。

表1 咖啡酸四聚體、丹酚酸B的含量測定結果（n＝3）Tab1 Content determination result of caffeic acid tetramer and salnianolic acid B（n＝3）

3 討論

本試驗以流動相作溶劑，在200～400 nm波長范圍內測定了咖啡酸四聚體紫外光譜圖，結果在252 nm波長處有最大吸收，故確定252 nm為測定波長。

本試驗比較了咖啡酸四聚體在甲醇與水中的穩定性[6，7]，其結果均在8 h內穩定，因水價廉易得，故選用水為溶劑。試驗中曾用甲醇-0.1%甲酸水（29∶71）為流動相，但主峰與鄰峰分離不佳，經摸索篩選采用甲醇-0.5%磷酸水（40∶60）分離效果理想。

目前，中成藥的質量控制標準多為單成分、單指標的含量控制，雖有的為有效成分，但實際上也只是指標性地控制，不能表達其整體的質量，達不到以“量”控制“質”的目的[8]。本試驗建立了以HPLC法同時測定復方紫草顆粒中咖啡酸四聚體、丹酚酸B含量的方法，并計算了組分含量的比例，該法具有操作簡便、結果可靠等特點，能夠應用于復方紫草顆粒的質量評價與質量控制。

[1]Robinson WE Jr，Reinecke MG，Abdel-Maleks，et al.Inhibitors of HIV-1 replication that inhibit HIV integrase[J].Proc Natl Acaid Sci USA，1996，61（5）：268.

[2]Abd-Elazem Is，Chen HS，Bates RB，et al.Is：lation of two highly potent and non-toxic inhibitors of human immunodeficiency Vinus type 1（HIV-I）integrase from salvia miltiorrhiza[J].Antiviral Researchy，2002，55（1）：91.

[3]秦德華，陳鴻珊，彭宗根.丹參中的一個新化合物及其抗HIV活性[J].中草藥，2004，35（7）：394.

[4]秦冬梅，買爾旦，賀金華.新疆軟紫草中咖啡酸四聚體對照品的制備[J].時珍國醫國藥，2007，18（8）：1857.

[5]Kashiwada Y，Nishizawa M，Yamaagishi T，et al.Anti-AIDS agents，18 sodium and potassium salts of caffeic acid tetramers from Arnebia euchroma as anti-HIV agents[J].J Nat Prod，1995，58（3）：392.

[6]賀金華，買爾旦.HPLC法測定新疆軟紫草中咖啡酸四聚體的含量[J].新疆醫科大學學報，2005，28（5）：429.

[7]吳月國，張 萍，馬麗萍，等.HPLC測定丹酚膠囊中丹酚酸B的含量[J].中成藥，2008，30（2）：291.

[8]肖 卉，孫江兵，周 軍.HPLC法同時測定復方明目膠囊中綠原酸和秦皮甲素的含量[J].中國藥房，2008，19（3）：209.