番石榴葉顆粒HPLC指紋圖譜研究

何宇新， 吳晶晶， 李 玲， 陳慧娟

（1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川成都 610039;2.四川省中醫(yī)藥研究院中醫(yī)研究所，四川成都 610031）

番石榴葉顆粒是由番石榴葉一味中藥組成的顆粒劑，主要用于糖尿病的治療。番石榴葉屬于桃金娘科番石榴屬的常綠灌木番石榴（Psidium guajavaLinn.）的葉子，用于治療急、慢性腸炎，痢疾，小兒消化不良，糖尿病等癥。現(xiàn)代研究表明番石榴葉的主要功效成分為芳香類二級(jí)代謝產(chǎn)物多酚類物質(zhì)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)含有槲皮素（quercetin）、萹蓄苷（avicularin）、番石榴苷（guaijacerin，C20H18O11）即槲皮素－3－α－L－吡喃阿拉伯糖苷等。試驗(yàn)表明，正是這些酚類化合物賦予番石榴葉多種功效［1－3］。本文對(duì)番石榴葉顆粒進(jìn)行指紋圖譜研究，為有效控制番石榴葉顆粒的質(zhì)量提供技術(shù)支持。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 日本島津高效液相色譜儀（LC－20高效液相色譜儀）;Milli－Q Academic超純水儀（密理博中國(guó)有限公司）;JJ1004小型超聲波清洗機(jī)（東莞市嘉勁機(jī)械有限公司）;中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004版（國(guó)家藥典委員會(huì)）。

1.2 試劑 甲醇為色譜純（美國(guó)迪馬DIKMA試劑公司）;槲皮素對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;番石榴葉顆粒顆粒（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 番石榴葉顆粒指紋圖譜方法學(xué)研究

2.1.1 色譜條件 色譜柱:C18（Scienhome 250 mm×4.6 mm），Agilent數(shù)據(jù)處理軟件。由預(yù)試驗(yàn)結(jié)果得出，流動(dòng)相:A:甲醇，B:0.4%磷酸水溶液，按表1進(jìn)行梯度洗脫。流速:1.00 mL/min;柱溫:40℃;檢測(cè)波長(zhǎng):360 nm;記錄時(shí)間70 min;進(jìn)樣量 10 μL。

表1 梯度洗脫表

2.1.2 參照物的選擇 番石榴葉顆粒中黃酮類成分的指標(biāo)成分主要為槲皮素，經(jīng)檢測(cè)在本色譜條件，槲皮素峰面積較大，分離度較高，其相對(duì)保留時(shí)間及峰面積較穩(wěn)定，故選擇槲皮素為參照物。

2.1.3 供試品溶液的制備 取自制的番石榴葉顆粒2 g，加甲醇20 mL超聲40 min，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇，微孔濾膜（0.45 μm）過(guò)濾，即得。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，對(duì)各共有峰的保留時(shí)間及峰面積進(jìn)行考察，結(jié)果表明相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1%、相對(duì)峰面積的RSD＜3%，說(shuō)明精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份樣品5份，按上述供試品溶液制備方法制得，每份進(jìn)樣1次，對(duì)各共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積進(jìn)行考察，結(jié)果表明，相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1%、相對(duì)峰面積RSD＜3%，說(shuō)明重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于0，2，4，6，8 h進(jìn)樣分析，對(duì)各共有峰相對(duì)相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積進(jìn)行考察，結(jié)果表明，相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1%、相對(duì)峰面積RSD＜3%;說(shuō)明在8 h內(nèi)，樣品溶液穩(wěn)定。

2.2 番石榴葉顆粒指紋色譜的建立

2.2.1 原藥材指紋圖譜的測(cè)定 精密稱取粉碎過(guò)100目篩的番石榴葉粉末0.1g，加20mL甲醇，稱定重量后超聲30 min，補(bǔ)足失重，過(guò)濾即得。其色譜圖見圖1所示。

圖1 番石榴葉原藥材指紋圖譜

2.2.2 樣品的測(cè)定及共有峰的指定 取10批自制的番石榴葉顆粒，分別按供試品溶液的制備方法制備，再按表1所示方法進(jìn)行HPLC指紋圖譜測(cè)定。通過(guò)比較10批供試品溶液的指紋圖譜，其中有10個(gè)峰為各樣品所共有，6號(hào)峰不是絕對(duì)意義上的一個(gè)峰，它是由兩個(gè)分離不完全的峰組成，這2個(gè)峰在每批色譜圖上都出現(xiàn)，但分離欠佳，按《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》［4］將其整體看做一個(gè)峰;10號(hào)峰為一強(qiáng)峰，經(jīng)與槲皮素對(duì)照品進(jìn)行比較，確定此峰為槲皮素的特征峰。最后確定10個(gè)峰為共有峰（見圖2），樣品的總出峰數(shù)為39個(gè)峰，共有峰面積占總峰面積的92.2%，且其中超過(guò)總峰面積5%的色譜峰有6個(gè)，分別為5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、10號(hào)。

圖2 番石榴葉顆粒指紋圖譜共有峰的標(biāo)定

2.2.3 樣品共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積 以10號(hào)峰為參照峰，其α值為1，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其中，6號(hào)峰以兩峰的平均保留時(shí)間、平均峰面積同參照峰比較。結(jié)果如表2、3所示，各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積均小于2%。符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》中的有關(guān)規(guī)定。

表2 指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間

2.2.4 相似度計(jì)算 利用國(guó)家藥典委員會(huì)的“中藥色譜指紋圖譜相似性評(píng)價(jià)系統(tǒng)”對(duì)所選取的10個(gè)共有峰進(jìn)行相似度計(jì)算。譜峰處理:自動(dòng)譜峰匹配;時(shí)間窗寬度:0.2;相似度計(jì)算（全譜）見表4。以S5為參照?qǐng)D譜，其全譜相似度分別為 0.982、0.982、0.985、0.920、0.920、0.920、0.984、0.985、0.982、0.984;即10批樣品的相似度均在0.9以上，符合質(zhì)量要求。

表3指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積

表4 10批樣品HPLC指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果

3 討論

3.1 番石榴葉顆粒是以單味藥為原料，經(jīng)過(guò)提取、濃縮、除雜、干燥、制粒等工藝制成顆粒狀制劑。本文對(duì)番石榴葉顆粒的指紋圖譜進(jìn)行研究，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

3.2 流動(dòng)相的選擇 本試驗(yàn)比較了等度洗脫和梯度洗脫對(duì)指紋圖譜的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，等度洗脫得到的峰分離效果不好，色譜峰也較少，故確定使用梯度洗脫使樣品中不同極性組分均獲得了合適的保留值;本試驗(yàn)考察了甲醇－水梯度洗脫，甲醇－0.4%磷酸水溶液梯度洗脫。比較色譜圖，甲醇－0.4%磷酸水溶液系統(tǒng)出峰峰形較好，無(wú)拖尾現(xiàn)象，基線較平。故選擇甲醇－0.4%磷酸水溶液系統(tǒng)梯度洗脫分離。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 在選定的色譜條件下，結(jié)合DAD檢測(cè)器得到的三維圖譜，最終確定360 nm處，出峰較多，峰形較好，分離度較好，基線平穩(wěn)。故選擇360 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 檢測(cè)時(shí)間的測(cè)定 在選定的色譜條件下，進(jìn)行一次2 h的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)70 min后，沒有新的峰出現(xiàn)，故確定檢測(cè)時(shí)間為70 min。

［1］黃建林，張展霞.GC－MS分析番石榴葉乙醇提取物的化學(xué)成分［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，43（6）:117－121.

［2］Harborne J B.Plant phenolics［M］.Academic press，New York:1989.

［3］Begum S，Hassan SI，Siddiqui BS，et al.Triterpenoids from the leaves of Psidium guajava［J］.Phytochemistry，2002，61（4）:399－403.

［4］國(guó)家藥品監(jiān)督管理局.中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）［J］.中成藥，2000，22（10）:671－675.