甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B對(duì)PAF誘導(dǎo)家兔血小板聚集和釋放產(chǎn)物的影響

劉 洪， 潘蘇華， 劉成鼎， 韋 敏， 許惠琴*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)圖書館，江蘇南京 210046;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210046）

血栓形成和血栓栓塞性疾病與血小板活化因子PAF直接相關(guān)，它是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的血小板聚集誘導(dǎo)劑［1］。研究表明銀杏內(nèi)酯B（GB）是血小板活化因子特異性受體拮抗劑［2］，然而GB水溶性極小，臨床使用受限。為使GB在治療血栓性疾病方面有更廣泛的應(yīng)用，我們?cè)贕B母核上增加新的基團(tuán)合成衍生物甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B，增加了水溶性，見結(jié)構(gòu)式圖。本試驗(yàn)旨在考察甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B對(duì)血小板聚集和釋放反應(yīng)的影響，探討其治療血栓性疾病的特點(diǎn)及作用機(jī)制。

分子式:C24H33O10N·CH4O3S甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B（dimethylaminoethyl ginkgolide B mesylate）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與主要試劑 甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B，白色結(jié)晶（純度＞98%，分子量為591.63 g/moL），由南京柯菲平醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司提供，用生理鹽水配制。銀杏內(nèi)酯B（GB），白色結(jié)晶（分子量為424.4 g/moL），購(gòu)自合肥標(biāo)品生物技術(shù)有限公司，用二甲基亞砜配制。曲克蘆丁注射液:天津藥業(yè)焦作有限公司。血小板活化因子（PAF）:SIGMA公司。鈣離子指示劑Fluo－3－AM:Ivitrogen公司。TXB2放免試劑盒，6－keto－PGF1α放免試劑盒，購(gòu)自北京華英生物技術(shù)研究所。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)AR級(jí)。

1.1.2 動(dòng)物 ♂性新西蘭家兔，由南京江寧縣湯山青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK（蘇）2002－0027。

1.1.3 儀器 FA－2104上皿電子天平（上海精科天平）。LDZ5－2離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）。XSP－13型光學(xué)顯微鏡（南京江南光學(xué)儀器廠）。PAPERI型血小板聚集及血凝測(cè)定儀（北京世帝科學(xué)儀器公司）。ZT－Ⅲ多頭細(xì)胞樣品收集器（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。SpectraMax? Gemini XS微孔板熒光檢測(cè)儀（Molecular Devices公司）。DFM－96型16管放射免疫γ計(jì)數(shù)器（合肥眾成機(jī)電技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B對(duì)PAF誘導(dǎo)家兔血小板聚集的影響

取♂性家兔48只，體重2.0～2.5 kg，隨機(jī)分為6組:①對(duì)照組:0.9%氯化鈉注射液。②曲克蘆丁組:24 mg/kg。③GB組:3.90 mg/kg。④甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯BⅠ組:1.95 mg/kg。⑤甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯BⅡ組:3.90 mg/kg。⑥甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯BⅢ:7.80 mg/kg。耳緣靜脈連續(xù)給藥5 d，給藥容積均為0.5 mL/kg。末次給藥15 min后頸總動(dòng)脈取血，用3.8%檸檬酸鈉抗凝，血液與檸檬酸鈉容積之比為9∶1。800 r/min離心10 min后吸取上層血漿即得PRP。將剩余血液2 500 r/min離心10 min后吸取上層血漿即得貧血小板血漿（PPP）［3，4］。對(duì) PRP 進(jìn)行計(jì)數(shù)，若血小板濃度較高，則用PPP稀釋至360×109/L。先用250 μL PPP 進(jìn)行定標(biāo)，然后取 250 μL PRP加入測(cè)試杯中，在37℃預(yù)溫槽中預(yù)熱1 min后放入測(cè)試孔，按“開始”鍵時(shí)立即加入誘導(dǎo)劑0.01 mg/mL PAF 10 μL，測(cè)定最大聚集率，每只家兔同時(shí)測(cè)定4個(gè)測(cè)試孔取均值［5］。用公式計(jì)算血小板聚集抑制率［6］。

1.2.2 甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B對(duì)PAF誘導(dǎo)家兔血小板釋放產(chǎn)物的影響

各組末次給藥后15 min取血，制備 PRP和PPP，進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)。

1.2.2.1 甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B對(duì)PAF誘導(dǎo)家兔血小板釋放Ca2+的影響

（1）Flou－3－AM 導(dǎo)入血小板:在 4 mL PRP 中加入 4 μL Flou－3－AM（Flou－3－AM 用 DMSO 溶液配成 1 mg/mL）置37℃ 30 min，用Hepes緩沖液洗滌二次（800 r/min離心10 min，加入等體積Hepes緩沖液進(jìn)行沖洗），混懸血小板（濃度大約為150×109/L）在Hepes緩沖液中待測(cè)。

（2）熒光測(cè)量:取上述負(fù)載Flou－3血小板懸液在熒光分光光度計(jì)上測(cè)定光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)為505 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm），計(jì)算血小板［Ca2+］i。

1.2.2.2 甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B對(duì)PAF誘導(dǎo)家兔血小板中TXA2和PGI2含量的影響

放射免疫法（RIA）測(cè)定PAF誘導(dǎo)家兔血小板中TXA2和PGI2含量。由于TXA2和PGI2在37℃下性質(zhì)不穩(wěn)定，很快水解為穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物TXB2和 6－keto－PGF1α，因此可測(cè)定 TXB2和 6－keto－PGF1α的含量來(lái)反映TXA2和PGI2的水平。取血小板數(shù)為360 ×109/L PRP 500 μL，加 20 μL 0.01 mg/mL PAF 反應(yīng)5 min 后，立即加入20 μL 10 μmol/L 消炎痛終止反應(yīng)。然后離心（1 200 r/min，5 min），取上清400 μL于－20℃保存，按RIA試劑盒說(shuō)明書測(cè)定 TXB2和 6－keto－PGF1α含量。

2 結(jié)果

2.1 甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B對(duì)PAF誘導(dǎo)家兔血小板聚集的影響

甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B 1.95、3.90、7.80 mg/kg 3個(gè)劑量組、GB3.90 mg/kg組和曲克蘆丁24 mg/kg組對(duì)PAF誘導(dǎo)的家兔血小板聚集率有抑制作用，與空白對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.01）。見表1。

表1 甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B對(duì)PAF誘導(dǎo)家兔血小板聚集的影響（x ± s，n=8）Tab.1 Influence of dimethylaminoethyl ginkgolide B mesylate on PAF-induced platelet aggregation in rabbit（x ± s，n=8）

2.2 甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B對(duì)PAF誘導(dǎo)家兔血小板釋放產(chǎn)物的影響

2.2.1 甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B對(duì)PAF誘導(dǎo)家兔血小板釋放Ca2+的影響

甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B1.95、3.90、7.80 mg/kg 3個(gè)劑量組對(duì)PAF誘導(dǎo)家兔血小板釋放Ca2+均有抑制作用，在激發(fā)后10 min內(nèi)與空白對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.01）。曲克蘆丁（24 mg/kg）和GB（3.90 mg/kg）對(duì)PAF誘導(dǎo)家兔血小板釋放Ca2+有抑制作用，與空白對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.01）。見表2。

2.2.2 甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B對(duì)PAF誘導(dǎo)家兔血小板中 TXB2、6－keto－PGF1α含量的影響

甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B1.95、3.90、7.80 mg/kg 3個(gè)劑量組對(duì)PAF誘導(dǎo)家兔血小板釋放TXB2有抑制作用，并可降低 TXB2/6－keto－PGF1α比值，其中甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B7.80 mg/kg劑量組與空白對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）。見表3。

表2 甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B對(duì)PAF誘導(dǎo)家兔體外血小板釋放Ca2+的影響（x ± s，n=8）Tab.2 Influence of dimethylaminoethyl ginkgolide B mesylate on the release of Ca2+from PAF-induced platelet in rabbits（x ± s，n=8）

表3 甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B對(duì)PAF誘導(dǎo)家兔血小板中TXB2、6-keto-PGF1α含量的影響（x ± s，n=8）Tab.3 Influence of dimethylaminoethyl ginkgolide B mesylate on the contents of TXB2and 6-keto-PGF1α from PAF-induced platelet in rabbits（x ± s，n=8）

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B對(duì)PAF誘導(dǎo)的家兔血小板聚集有抑制作用，能減少血小板釋放 Ca2+、TXB2，降低 TXB2/6－keto－PGF1α比值。以上研究中，我們選取了曲克蘆丁和GB這兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照藥。既住研究發(fā)現(xiàn)，曲克蘆丁體內(nèi)給藥對(duì)PAF、ADP、AA、COL 有抑制作用［7］。曲克蘆丁系蘆丁經(jīng)羥乙基化制成的半合成黃酮化合物，能夠增加紅細(xì)胞和血小板表面電荷密度，抑制紅細(xì)胞和血小板聚集，加強(qiáng)體內(nèi)纖維蛋白溶解活性。而GB是甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B的前體藥物，在血小板聚集和釋放反應(yīng)中，甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B與GB具有相似的藥理活性，均能抑制血小板聚集，抑制血小板釋放Ca2+、TXB2等活性物質(zhì)。由于甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B增加了水溶性，若作為新藥注射液開發(fā)具有一定的市場(chǎng)前景。

Ca2+是血小板代謝與功能的一個(gè)重要因子［8］，它參與血小板激活的許多重要環(huán)節(jié)，包括形狀變化、聚集和釋放。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度（［Ca2+］i）的平衡主要由細(xì)胞內(nèi)鈣釋放和外鈣內(nèi)流決定。細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的調(diào)節(jié)有兩個(gè)最經(jīng)典的通道，三磷酸肌醇（IP3）信號(hào)調(diào)節(jié)通路和Ryanodine信號(hào)調(diào)節(jié)通路。本研究中，PAF激活膜磷脂酶C，催化磷脂酰肌醇水解，產(chǎn)生二脂酰甘油和三磷酸肌醇促使Ca2+由血小板內(nèi)的致密管道系統(tǒng)釋放，并促使Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致血小板內(nèi)游離Ca2+濃度升高進(jìn)而觸發(fā)其聚集和釋放功能，使血液循環(huán)障礙進(jìn)一步發(fā)展。甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B可以抑制對(duì)PAF誘導(dǎo)的家兔血小板釋放Ca2+。由于GB是PAF受體特異性拮抗劑，因此推測(cè)，甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制PAF與PAF受體的結(jié)合，從而降低PAF誘導(dǎo)家兔血小板Ca2+的釋放。

TXA2是血小板活化的強(qiáng)誘導(dǎo)劑，也是一種致血管收縮和平滑肌細(xì)胞分裂的生物活性物質(zhì)。主要由血小板合成，但也可以由單核細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）合成［9］。PGI2是 TXA2的內(nèi)源性拮抗劑，具有抗血小板和血管的生物活性。主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成［10］。二者的平衡狀態(tài)關(guān)系到血管健康與否。甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B可以抑制TXB2的釋放，降低 TXB2/6－keto－PGF1α比值。甲磺酸胺銀杏內(nèi)酯B可能通過(guò)血小板內(nèi)多重生物放大效應(yīng)平臺(tái)，調(diào)節(jié)血小板內(nèi)高度表達(dá)的COX－1和血栓素合成酶，從而抑制活化的血小板中TXA2合成。

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