不同貯藏年限廣陳皮黃酮類成分的變化規律研究

鄭國棟， 蔣 林， 楊 雪， 楊得坡， 周 芳， 林樂維

（1.中山大學藥學院，廣東廣州 510006;2.廣州醫學院基礎學院，廣東 廣州 510182;3.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208）

廣陳皮為我國嶺南地區著名傳統中藥材，位列十大廣藥之一。《中國藥典》（2005版）記載，陳皮為蕓香科柑橘屬植物橘（Citrus reticulataBlanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮，其藥材可分為陳皮及廣陳皮，質量以廣陳皮為優［1］。廣陳皮正品為茶枝柑（Citrus reticulata‘Chachi’）的干燥成熟果皮，主產于廣東新會，又名新會陳皮。具有理氣健脾、和胃止嘔、燥濕化痰等多種功效［2］。除揮發油外，廣陳皮主含黃酮類成分，其黃酮類成分有兩大類型:一類是黃酮苷類，主要為二氫黃酮類成分，如橙皮苷、柚皮苷等;一類是多甲氧基黃酮類，主要有川陳皮素、橘皮素等。

陳皮有“陳久者良”之說，如梁代陶弘景曰“橘皮療氣大勝，須陳久者良”，宋代蘇頌云“以陳久者入藥良”。目前，已有一些科學研究對這一說法進行了驗證?？傮w來看，在揮發油方面的結論比較一致，即陳皮揮發油總量隨貯藏時間的延長有下降的趨勢［3，4］;在黃酮類成分方面的研究，則意見不一，且多參考《中國藥典》僅以橙皮苷為指標對不同貯藏年限陳皮中該類成分的含量進行了測定［5－8］。

因此，鑒于廣陳皮主含黃酮類成分，且該類成分有豐富的藥理活性［9－15］，除橙皮苷外，本實驗還選擇了4個多甲氧基黃酮（polymethoxylated flavones，PMFs）——川陳皮素、3，5，6，7，8，3′，4′－七甲氧基黃酮、橘皮素、5－羥基－6，7，8，3′，4′－五甲氧基黃酮作為指標對10批不同貯藏年限廣陳皮黃酮類成分的變化規律進行了進一步的研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜系統:Shimadzu LC－20AT高效液相色譜儀，SPD－20A紫外－可見分光檢測器，7725i注射閥（20 μL，Rheodyne，USA），LC solution色譜工作站軟件;Milli－Q plus system超純水儀（Millipore，Milford，MA，USA）;KUDOS SK250 LH 超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）;Anke TDL－5型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 材料 10批不同貯藏年限廣陳皮藥材（1年到33年）系從廣東省江門市新會區廣東省水果良種苗木繁育場及新寶堂陳皮有限公司采集，藥材經中山大學藥學院生藥學實驗室楊得坡教授及蔣林研究員鑒定為茶枝柑（Citrus reticulata‘Chachi’）的干燥成熟果皮。橙皮苷、川陳皮素、3，5，6，7，8，3′，4′－七甲氧基黃酮、橘皮素、5－羥基－6，7，8，3′，4′－五甲氧基黃酮5種對照品由筆者從廣陳皮藥材中制備分離得到，經理化鑒別、光譜解析對其結構進行了確證，HPLC峰面積歸一化法測定結果表明其純度均大于98%。

1.3 試劑 色譜純試劑:乙腈（Tedia Company，Fairfield，USA）;分析純試劑:甲醇（天津市富宇精細化工有限公司）;怡寶純凈水（怡寶食品飲料有限公司）;超純水（自制）。

2 方法與結果

2.1 HPLC色譜條件 色譜柱:DIKMA Diamonsil C18column（250 mm × 4.6 mm，i.d.，5 μm）;流動相:乙腈－水;流速:1 mL/min;柱溫:25℃;進樣量:20 μL;檢測波長:283 nm（橙皮苷）及330 nm（多甲氧基黃酮）雙波長檢測。梯度洗脫程序:0～15 min，25% ～50% 乙腈;15～35 min，50% ～60% 乙腈;35～40 min，60% ～85% 乙腈。在該條件下，廣陳皮藥材及對照品分離色譜圖見圖1。

圖1 對照品（a）及廣陳皮藥材（b）HPLC分析色譜圖

2.2 供試品溶液的制備 取廣陳皮藥材，打粉、過140目篩，取0.4 g精密稱定。加入40 mL甲醇，超聲提取30 min。4 000 r/min離心5 min，取上清液，濃縮后定容至25 mL量瓶中。溶液經微孔濾膜過濾，即得。

2.3 對照品溶液的制備 分別精密稱取橙皮苷（1，hes）、川陳皮素（2，nob）、3，5，6，7，8，3′，4′－七甲氧基黃酮（3，hep）、橘皮素（4，tan）和 5－羥基－6，7，8，3′，4′－五甲氧基黃酮（5，pen）5 種自制對照品，用適量甲醇溶解并定容，使之濃度分別為1.248、0.384、0.344、0.408、0.356 mg/mL，并作為標準貯備液，4℃保存、備用。臨用前，用甲醇將貯備液稀釋到適當濃度，即為對照品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍、檢測限及定量限考察 精密稱取對照品貯備液，用甲醇稀釋配制成6個濃度水平。按建立的色譜條件，分別對不同濃度的對照品溶液進行分析，每樣重復測定3次，取峰面積平均值。分別以對照品1～5的濃度X（μg/mL）為橫坐標、峰面積值Y為縱坐標進行回歸計算?；貧w方程、線性范圍、相關系數見表 1。檢測限（LOD）和定量限（LOQ）分別是當信噪比（S/N）為3和10時，化合物的濃度（μg/mL），結果見表1。

2.4.2 精密度試驗 分別取高、中、低3個濃度的混合對照品溶液。進樣分析，每個濃度日內測6次，連續測6 d。經計算，對照品中黃酮類成分1～5的日內及日間測定濃度的RSD均小于5%，同時準確度在95.16%～104.71%之間，表明測定方法的精密度符合分析要求。

表1標準曲線數據表（n=3）Tab.1 Calibration data for flavonoids 1～5（n=3）

2.4.3 重復性試驗 取同一批廣陳皮藥材6份，按供試品溶液的制備方法制備，測定供試品中黃酮化合物1～5的含量。經計算，5個黃酮化合物的保留時間和含量測定值的RSD均小于3%，表明測定方法的重復性良好。

2.4.4 穩定性試驗 取同一份藥材，按供試品溶液的制備方法制備，分別于 0、2、4、6、8、10、24、48 h 進樣，測定供試品中黃酮化合物1～5的含量。經計算，5個黃酮化合物的保留時間和含量測定值的RSD均小于3%，表明供試品溶液在48 h內穩定。2.4.5 回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品6份，每份0.2 g，加入混合對照品溶液適量，按供試品溶液的制備方法制備，進樣分析，計算加樣回收率。經計算，5個黃酮化合物的平均加樣回收率在96.91% ～103.20%之間，RSD值均小于5%，表明方法的準確度良好。

2.5 樣品含量測定 10批不同貯藏年限廣陳皮藥材，按供試品溶液的制備方法制備，進樣分析，平行3次，用外標法計算藥材中5個黃酮化合物的含量。10批藥材含量測定結果見表2。藥材黃酮類成分含量變化趨勢見圖2。

圖2 不同貯藏年限廣陳皮中主要黃酮類成分含量變化趨勢圖

由表2可知，10批不同貯藏年限廣陳皮藥材中橙皮苷的含量均在35 mg/g以上，符合《中國藥典》（2005版）規定的標準（以百分含量計，≧3.5%）;除橙皮苷外，廣陳皮黃酮類成分的含量以川陳皮素及橘皮素為高，3，5，6，7，8，3′，4′－七甲氧基黃酮和 5－羥基－6，7，8，3′，4′－五甲氧基黃酮含量較低。

3 結論與討論

由圖2可知，廣陳皮中5個主要活性黃酮成分的含量隨貯藏年限的不同，存在一定的變化，其變化趨勢基本一致;開始時，黃酮類成分的含量隨貯藏年限的延長有一定增加趨勢，隨后出現一定反復，但出現反復的現象更可能是由于藥材質量難以統一所致。從藥材采樣情況來看，前3批為同一產地，貯藏時間明確，藥材質量較為統一;后7批為藥店市售藥材，由于受到采樣時間、采樣地點、果樹樹齡、加工方式、貯藏條件及商品流通等因素的影響，藥材質量難以統一。

表2 不同貯藏年限廣陳皮藥材中主要黃酮類成分的含量（n=3）

在以黃酮類成分為指標探討陳皮“陳久者良”方面，曹臣等［5］認為橙皮苷是一種黃酮類苷，由蕓香糖基與橙皮苷元組成，存放時間越長，陳皮內含的蕓香糖與橙皮苷元結合形成的橙皮苷越多，故含量越高;林林等［6］認為，不同年份新會陳皮貯存期越長，總黃酮含量和橙皮苷含量越高;而易侖朝等［7］及丁春光等［8］則認為，不同貯存年限陳皮黃酮類化合物含量隨貯存時間變化較小。

因此，結合前人的研究工作，筆者認為，隨貯藏時間的延長，廣陳皮黃酮類成分的含量有一定增高趨勢;含量增高的原因比較復雜，既有可能與藥材貯藏過程中相關酶的活性變化有關，又有可能與藥材所含揮發性成分的散失有關，另外，大量文獻資料表明［16－18］，植物本身所含的內生菌可以產生并促進藥材活性成分的累積。因此，陳皮“陳久者良“這一說法有一定的科學依據，可能是各種原因綜合導致其活性成分在貯存過程中累積增加所致，具體原因尚待進一步驗證。

4 致謝

衷心感謝新會農業局、新會陳皮協會、廣東省水果苗木繁育場、新寶堂陳皮有限公司等單位在樣品采集及基地建設方面對本項目工作的大力支持和協助。

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