牛耳朵苯乙醇苷類化學成分及其細胞毒活性研究

陳文娟， 文永新， 陳月圓， 黃永林， 李典鵬*

（1.廣西壯族自治區中國科學院廣西植物研究所，廣西 桂林 541006;2.廣西師范大學生命科學學院，廣西桂林 541004）

全世界苦苣苔科（Gesneriaceae）植物約有140屬，近3 000種，我國有56屬（其中28屬特產我國），約413種［1］。據中國中藥資源志要記載，苦苣苔科植物多供藥用，具有清熱解毒、解表、祛風、利濕、消腫止痛、止咳、祛痰、溫補養血等功效;對于諸多炎癥、咳喘、疔瘡、風濕、跌打、燙傷、蛇蟲咬傷及婦科疾病有較好療效［2］。

牛耳朵（Chirita eburneaHance）又名石三七、石虎耳，為苦苣苔科唇柱苣苔屬植物，根莖或全草入藥，多年生草本，根粗壯;生于石山，丘陵或山地溪邊，分布于廣西、廣東、湖南、湖北、四川及貴州等地。牛耳朵性味甘、平，有補虛、止咳、止血、除濕的功效［1］。牛耳朵根莖具有清肺、止血、解毒、治肺結核等功用，在廣西民間廣泛用來治療肺結核、高血壓等病［3］。國內外對牛耳朵的化學成分研究較少，僅蔡祥海等［4－6］從牛耳朵乙酸乙酯部位中分離鑒定了5個蒽醌類化合物，7個甾體類化合物，1個具萘醌母核的含氮新化合物和1個三萜化合物;陳文娟等［7］采用GC－MS方法鑒定了牛耳朵乙醇浸膏中的24種脂溶性成分。尚未見有文獻報道牛耳朵正丁醇部位的化學成分，本研究從牛耳朵正丁醇部位分離鑒定了5個苯乙醇苷類化合物并對它們的細胞毒活性進行研究，發現化合物4、5對人肺癌SPC－A1細胞株具有一定的細胞毒作用，化合物1～5對肝癌HepG2細胞株、胃癌SGC－7901細胞株、人肺大細胞癌NCIH460細胞株都不具有細胞毒性。

1 儀器與材料

核磁共振波譜儀:ΑMX－500 MHz（德國 BRUKER公司），以 TMS為內標;質譜儀:ESQUIRE HCT（美國Bruker.Daltonics公司）;薄層層析硅膠、柱層析硅膠（200～300目）均為青島海洋化工廠產品;常用溶劑均為分析純;肺癌 SPC－A1細胞株、肝癌HepG2細胞株、胃癌SGC－7901細胞株、人肺大細胞癌NCI－H460細胞株均引自中國科學院上海藥物研究所。RPMI－1640（Lot#1120708）GIBCO 公司;MTT（Lot#0793）Amresco公司;小牛血清（Lot#050623）杭州四季青生物工程有限責任公司;樣品于2008年7月采自廣西桂林市雁山鎮，經廣西植物研究所韋發南研究員鑒定為苦苣苔科唇柱苣苔屬植物牛耳朵Chirita eburneaHance。

2 實驗方法

2.1 提取和分離 新鮮牛耳朵10 kg，室內陰干，用75%乙醇加熱回流提取兩次（每次3 h），減壓濃縮，得浸膏700 g。用適量的水溶解浸膏，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，濃縮正丁醇萃取液得浸膏200 g。正丁醇部位40 g經硅膠，MCI，Diaion HP－20，sephadex LH－20及ODS柱層析反復分離得到化合物1（81.8 mg），化合物2（65.9 mg），化合物3（90.4 mg），化合物 4（88.2 mg），化合物5（95.8 mg）。

2.2 細胞毒活性試驗 MTT法［8］檢測化合物1～5對人肺癌SPC－A1細胞株、肝癌HepG2細胞株、胃癌SGC－7901細胞株、人肺大細胞癌 NCI－H460細胞株的細胞毒性。

3 結構鑒定

化合物1:黃白色無定形粉末，具吸濕性，易溶于甲醇。遇 FeCl3－K3［Fe（CN）6］試劑顯藍色，示為酚性物質。ESI－MSm/z:479［M+H］+。1H－NMR（CD3OD，500 MHz）δ:7.59（1H，d，J=16 Hz，H－β″），7.07（1H，d，J=2 Hz，H－2″），6.96（1H，dd，J=2 和 8 Hz，H－6″），6.79（1H，d，J=8 Hz，H－5″），6.69（1H，d，J=2 Hz，H－2），6.67（1H，d，J=8 Hz，H－5），6.56（1H，dd，J=2 和8 Hz，H－6），6.34（1H，d，J=16 Hz，H－α″），5.06（1H，t，J=9 Hz，H－3′），4.42（1H，d，J=8 Hz，H－1′），4.05（1H，m，H－α），3.89（1H，dd，J=2 和 12 Hz，H－6′），3.73（2H，m，H－α 和 H－6′），3.55（1H，t，J=9 Hz，H－4′），3.41（2H，m，H－2′和 H－5′），2.78（2H，m，H2－β）。13CNMR（CD3OD，125 MHz）數據見表1。以上數據和文獻［9］報道的plantainoside Α數據一致。故鑒定該化合物為:3，4－二羥基苯乙醇－3－O－咖啡酰基－β－D－葡萄糖苷（plantainoside Α）。化合物1的結構圖見圖1。

化合物2:黃白色無定形粉末，具吸濕性，易溶于甲醇。遇 FeCl3－K3［Fe（CN）6］試劑顯藍色，示為酚性物質。ESI－MSm/z:641 ［M+H］+。1H－NMR（CD3OD，500 MHz）δ:7.56（1 H，d，J=16 Hz，H－β″），7.17（1H，d，J=8.5 Hz，H－5″），7.09（1 H，d，J=2 Hz，H－2″），6.90（1 H，dd，J=2 和 8.5 Hz，H－6″），6.68（1 H，d，J=2 Hz，H－2），6.65（1 H，d，J=8 Hz，H－5），6.53（1 H，dd，J=2 和 8 Hz，H－6），6.36（1 H，d，J=16 Hz，H－α″），4.89（1 H，d，J=7 Hz，H－1?），4.52（1 H，dd，J=2 和 12 Hz，H－6′），4.34（1 H，d，J=8 Hz，H－1′），4.32（1 H，dd，J=6 和 12 Hz，H－6′），2.79（1 H，t，J=7.5 Hz，H2－β）。13CNMR（CD3OD，125 MHz）數據見表1。以上數據和文獻［10］報道的chiritoside C數據一致。故鑒定該化合物為:3，4－二羥基苯乙醇－6－O－葡萄糖咖啡酰基－β－D－葡萄糖苷（chiritoside C）。化合物2的結構圖見圖1。

化合物3:黃白色無定形粉末，具吸濕性，易溶于甲醇。遇 FeCl3－K3［Fe（CN）6］試劑顯藍色，示為酚性物質。ESI－MSm/z:479 ［M+H］+。1H－NMR（CD3OD，500 MHz）δ:7.58（1 H，d，J=16 Hz，H－β″），7.09（1 H，d，J=2 Hz，H－2″），6.98（1 H，dd，J=2 和8 Hz，H－6″），6.81（1 H，d，J=8.5 Hz，H－5″），6.63（1 H，d，J=2 Hz，H－2），6.60（1 H，d，J=8 Hz，H－5），6.49（1 H，dd，J=2 和 8 Hz，H－6），6.30（1 H，d，J=16 Hz，H－α″），4.81（1 H，dd，J=9 和 8 Hz，H－2′），4.52（1 H，d，J=8 Hz，H－1′），3.99（1 H，m，H－α），3.89（1 H，dd，J=2 和 12 Hz，H－6′），3.72（1 H，dd，J=6 和 12 Hz，H－6′），3.64（1 H，m，H－α），3.59（1H，t，J=9 Hz，H－3′），3.42（1 H，t，J=9 Hz，H－4′），3.32（1H，m，H－5′），2.67（2 H，m，H2－β）。13CNMR（CD3OD，125 MHz）數據見表 1。以上數據和文獻［9］報道的plantaninoside B數據一致。故鑒定該化合物為:3，4－二羥基苯乙醇－2－O－咖啡酰基－β－D－葡萄糖苷（plantaninoside B）。化合物3 的結構圖見圖1。

化合物4:黃白色無定形粉末，具吸濕性，易溶于甲醇。遇 FeCl3－K3［Fe（CN）6］試劑顯藍色，示為酚性物質。ESI－MSm/z:641［M+H］+。1H－NMR（CD3OD，500 MHz）δ:7.54（1 H，d，J=16 Hz，H－β″），7.03（1 H，d，J=2 Hz，H－2″），6.94（1 H，dd，J=2 和 8 Hz，H－6″），6.75（1 H，d，J=8 Hz，H－5″），6.70（1 H，d，J=2 Hz，H－2），6.66（1 H，d，J=8 Hz，H－5），6.52（1 H，dd，J=2 和 8 Hz，H－6），4.90（1 H，t，J=9 Hz，H－4′），3.90（1 H，t，J=9 Hz，H－3′），2.75（2 H，m，H2－β）。13CNMR（CD3OD，125 MHz）數據見表1。以上數據和文獻［11］報道的plantamajoside數據一致，故鑒定該化合物為:3，4－二羥基苯乙醇－β－D－葡萄糖（1→3）－4－O－咖啡酰基－β－D－葡萄糖苷（plantamajoside）。化合物4的結構圖見圖1。

化合物5:黃白色無定形粉末，具吸濕性，易溶于甲醇。遇 FeCl3－K3［Fe（CN）6］試劑顯藍色，示為酚性物質。ESI－MSm/z:479［M+H］+。1H－NMR（CD3OD，500 MHz）δ:7.56（1 H，d，J=16 Hz，H－β″），7.04（1 H，d，J=2 Hz，H－2″），6.96（1 H，dd，J=2 和 8 Hz，H－6″），6.79（1 H，d，J=8 Hz，H－5″），6.69（1 H，d，J=2 Hz，H－2），6.68（1 H，d，J=8 Hz，H－5），6.56（1 H，dd，J=2 和 8 Hz，H－6），6.30（1 H，d，J=16 Hz，H－α″），4.84（1 H，t，J=9 Hz，H－4′），4.37（1 H，d，J=8 Hz，H－1′），4.05（1 H，m，H－α），3.71（1 H，m，H－α），2.76（2 H，m，H2－β）。13CNMR（CD3OD，125 MHz）數據見表1。以上數據和文獻［12］報道的（desrhamnosyiverbascoside）數據一致。故鑒定該化合物為:3，4－二羥基苯乙醇－4－O－咖啡酰基－β－D－葡萄糖苷（desrhamnosylverbascoside）。化合物5的結構圖見圖1。

圖1 化合物1～5結構圖

表1化合物1～5的13C-NMR數據（CD3OD，125 MHz）

（續表1）

4 細胞毒活性評價

化合物1～5對人肺癌SPC－A1細胞株具有不同程度的抑制作用，化合物4、5對人肺癌SPC－A1細胞株具有弱的細胞毒作用，半抑制濃度（IC50）為207.23、180.34 μmol/L，化合物1 ～3 未顯示細胞毒性（IC50＞300 μmol/L）。化合物 1～5對肝癌HepG2細胞株、胃癌SGC－7901細胞株、人肺大細胞癌NCI－H460細胞株都不具有細胞毒性，其IC50＞300 μmol/L。

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