自動電位滴定法測定金釵石斛藥材中總生物堿的含量

華茉莉， 李定祥， 姜仁吉

（1.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 200040;2.上海先導(dǎo)藥業(yè)有限公司，上海 201203）

石斛為蘭科石斛屬植物，在我國約有70余種，主要分布在華南及西南地區(qū)，其中部分品種被收作藥用，統(tǒng)稱為石斛［1］。石斛具有益胃生津、滋陰清熱、潤肺止咳等功效，中醫(yī)常將之用于治療熱病傷津，口干煩渴，食少干嘔，病后虛熱，目暗不明等病癥。目前我國藥用石斛的植物來源較為廣泛，2005年版中國藥典（一部）收載的品種包括蘭科植物金釵石斛Dendrobium nobileLindl.、鐵皮石斛Dendrobium candidumWall.ex Lindl.、馬鞭石斛Dendrobium fimbritumHook.Var.oculatumHook.及其近似種的新鮮或干燥莖。近幾十年來國內(nèi)外學(xué)者對不同品種石斛開展的化學(xué)成分研究顯示不同品種石斛所含化學(xué)成分差異極大［2，3］，但國家標(biāo)準(zhǔn)對石斛僅建立了性狀和顯微鑒別，缺少有效的、可量化的檢測指標(biāo)，難以實現(xiàn)有效的品種區(qū)分和質(zhì)量控制。為此，國內(nèi)許多研究者不斷探索藥用石斛鑒別和質(zhì)量控制的有效方法［4］，甚至引入 DNA 分子標(biāo)記技術(shù)［5］，但實際應(yīng)用存在諸多問題。

金釵石斛作為藥用石斛的主要品種之一，植物中含有大量的生物堿且多為倍半萜型結(jié)構(gòu)，已分離鑒定了數(shù)十種生物堿［6］，其生物堿的含量與藥材質(zhì)量密切相關(guān)。由于金釵石斛中既含有脂溶性生物堿又含有水溶性的季銨型生物堿，且倍半萜型生物堿僅有較弱的紫外末端吸收，故常規(guī)色譜分析方法對其總生物堿的定量存在一定困難，以前研究者多以酸性染料分光光度法測定石斛中總生物堿的含量［7-9］，但操作繁瑣、穩(wěn)定性及重復(fù)性均不甚理想，測定結(jié)果誤差相對較大。為此，我們嘗試以自動電位滴定法測定金釵石斛藥材中總生物堿的含量。

1 儀器與試劑

Metrohm 809 Titrando自動電位滴定儀;Metrohm 6.0229.100復(fù)合玻璃電極;Mettler Toledo AL204型分析天平。

石斛堿對照品，自制（熔點134.3～136.5℃，GC歸一化法測定其純度為99.5%）;高氯酸滴定液（0.1 mol/L）以2005年版中國藥典一部附錄ⅩⅤF項下配制并標(biāo)定;732型陽離子交換樹脂，上海亞東核級樹脂有限公司;雙蒸水、其它所用試劑均為分析純;藥材購自四川合江，經(jīng)浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院張治國教授鑒定為蘭科石斛屬金釵石斛。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品的制備 取100 g干燥恒重的金釵石斛藥材粗粉，精密稱定，以10倍量90%乙醇回流提取3次，每次回流2 h，過濾，合并濾液，濃縮至無醇味，以200 mL 3%鹽酸充分溶解，過濾，濾液加去離子水稀釋至約400 mL，過強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂（樹脂用量控制在200～500 mL即可），以去離子水洗至中性后，以5%氨水-50%乙醇液洗脫，以生物堿的檢識反應(yīng)判定洗脫終點（上樣流速和洗脫流速控制在每小時流速1倍柱體積內(nèi)較佳），合并氨水洗脫液，減壓濃縮蒸干，即得供試品，同時稱重以計算得率。

2.2 自動電位滴定法 取上述供試品0.25 g，精密稱定，加冰醋酸30 mL完全溶解，將復(fù)合玻璃電極插入溶液中，選擇“等速滴定MET”模式，開動攪拌器，記錄pH變化，待儀器穩(wěn)定后，以高氯酸滴定液（0.1 mol/L）滴定，儀器以pH值突躍自動判定滴定終點，此滴定結(jié)果以空白試驗校正，滴定曲線見圖2所示。

每1 mL高氯酸滴定液（0.1 mol/L）相當(dāng)于26.3 mg的石斛堿（C16H25NO2），由此以石斛堿為基準(zhǔn)物折算金釵石斛藥材中所含總生物堿的百分含量。

2.3 專屬性試驗 自動電位滴定法測定金釵石斛藥材中總生物堿含量，基本原理是在非水溶液中以強(qiáng)酸滴定有機(jī)堿并以pH突躍自動判定滴定終點，因此藥材中非生物堿成分是否干擾滴定終點的判定是該方法是否可行的根本前提。為此，結(jié)合樣品的定性鑒別及滴定曲線進(jìn)行專屬性試驗考察，實驗步驟及結(jié)果見圖1、2及表1。

圖1 專屬性試驗樣品的制備

表1 金釵石斛不同提取樣品的定性鑒別及電位滴定結(jié)果

綜合以上試驗結(jié)果，證實金釵石斛中非生物堿組分及供試品在制備過程中可能存在的氨基酸成分均不干擾滴定終點的判定，因此本測定方法具有良好的專屬性。

圖2 自動電位滴定曲線

2.4 線性關(guān)系考察 取同批次供試品，分別精密稱定0.1、0.2、0.25、0.3、0.4 g，按2.2 項下方法測定，以供試品樣品量為橫坐標(biāo)，以消耗的高氯酸滴定液體積數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸分析，結(jié)果表明:供試品在0.1～0.4 g范圍內(nèi)，滴定液的消耗體積呈良好線性關(guān)系，線性方程y=30.78x－0.038，相關(guān)系數(shù)R=0.999 7。

2.5 精密度試驗 取同批供試品，精密稱定6份，按2.2項下方法操作，分別測定供試品中總生物堿含量，測定結(jié)果的RSD為0.25%，表明該方法穩(wěn)定可靠。

2.6 日內(nèi)穩(wěn)定性試驗 稱取供試品約1.65 g，加冰醋酸 200 mL 完全溶解，分別于0、1、2、3、4、6 h 精密吸取30 mL待測溶液按2.2項下方法滴定，高氯酸滴定液的消耗體積數(shù)RSD為0.35%，因此表明:供試品溶液在6 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.7 重復(fù)性試驗 取同批藥材6份，精密稱定，按2.1項下方法制備供試品并按2.2項下方法測定，并以石斛堿為基準(zhǔn)物折算出各份藥材中總生物堿的含量，藥材中總生物堿的含量測定結(jié)果 RSD為2.96%，表明該測定方法具有良好的重復(fù)性，符合含量測定的要求。

2.8 加樣回收率實驗 精密稱取同批藥材9份（與重復(fù)性試驗同批藥材，藥材中總生物堿含量以2.7項下測得的平均值計），分別精密加入適量的石斛堿對照品溶液，按2.1項下方法制備供試品，所得供試品加30 mL冰醋酸，待完全溶解后按2.2項下方法滴定，測定各份供試品中總生物堿含量，計算回收率，測得平均回收率為96.04%（RSD為0.60%），結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗

2.9 樣品的測定 選取從四川合江地區(qū)同一藥材收購商處購得的不同批次金釵石斛藥材，按2.1項下方法制備含量測定用供試品，并按2.2項下方法測定各批次藥材中總生物堿的含量，結(jié)果四川合江2004年購藥材，2005年購藥材，2008年購藥材總生物堿含量分別為0.85%、0.68%、1.03%。

從以上含量測定結(jié)果及筆者多年對金釵石斛的研究積累，金釵石斛藥材中總生物堿及單一石斛堿的含量，批次間的差異明顯;另外，金釵石斛俗稱“黃草”，其市售品常被其它品種石斛所替代和混用，因此對主要藥效成分的含量分析是藥材質(zhì)量控制的必要手段。

3 討論

3.1 金釵石斛中不僅含有脂溶性生物堿，還含有水溶性的季銨型生物堿，我們實驗研究證實金釵石斛醇提濃縮液的氯仿萃取層及水層對碘化鉍鉀檢識反應(yīng)均呈陽性，因此一些研究者以氯仿回流氨水浸潤過的藥材粗粉來制備石斛總生物堿含量測定用供試品的方法［7，8］，實際上難以達(dá)到藥材中總生物堿組分的有效完全提取。

3.2 本研究中雖證實金釵石斛藥材中非生物堿成分不干擾滴定終點的判定，但供試品中非生物堿成分的存在仍可能對測定結(jié)果帶來系統(tǒng)誤差，如延遲pH值突躍的反應(yīng)時間，使滴定值偏高等，因此總生物堿含量測定用供試品的制備方法應(yīng)保證有效提取待測成分的同時盡可能去除雜質(zhì)。我們通過研究比較，以醇提酸溶與離子交換樹脂方法可實現(xiàn)金釵石斛中不同極性生物堿組分的分離與富集，是較為理想的供試品制備方法。

3.3 采用強(qiáng)酸在非水溶液中滴定有機(jī)弱堿并以pH突躍自動判定滴定終點，基本實現(xiàn)了對金釵石斛藥材中極性相差懸殊的倍半萜型生物堿的總定量，試驗表明該方法簡便靈敏且穩(wěn)定可靠。

3.4 目前從金釵石斛中分離鑒定的生物堿多為倍半萜型骨架結(jié)構(gòu)，石斛堿是其中的主要成分，以氣相色譜法測得石斛堿在金釵石斛藥材中最高含量可達(dá)0.18%［10］，因此本方法中以石斛堿作為基準(zhǔn)物來折算金釵石斛中所有生物堿組分的含量，是相對可行的。

3.5 采用自動電位滴定法一定程度上解決了金釵石斛藥材中總生物堿不易有效定量的難題，但該方法離精準(zhǔn)定量尚有一定距離，因此對金釵石斛藥材的質(zhì)量控制，筆者建議在生物堿的薄層鑒別基礎(chǔ)上同時建立總生物堿和石斛堿的含量測定項，即以自動電位滴定法測定總生物堿含量和以氣相色譜法測定石斛堿的含量［10］，有利于全面準(zhǔn)確地評價藥材質(zhì)量。

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