嘌呤核苷酸補償對海洛因依賴大鼠嘌呤核苷酸代謝相關酶基因表達的影響

李 昆,何海濤,李鴻梅,劉劍凱,洪 敏*

(1.吉林大學白求恩醫學院生物化學教研室,吉林長春130021;2.吉林大學護理學院)

已有研究表明,嗎啡、海洛因等阿片類物質可引起嘌呤核苷酸分解過度[1,2],而合成代謝降低[3,4]。可見,在長期使用阿片的過程中嘌呤核苷酸虧欠可能是造成藥物依賴的機制之一。外源性補償核苷酸對海洛因所致的嘌呤核苷酸代謝改變是否有改善作用目前尚無報道。本研究旨在探討補償嘌呤核苷酸對海洛因依賴大鼠嘌呤核苷酸代謝相關酶基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及設備 正常雄性Wistar大鼠,體重180-200 g,吉林大學醫學實驗動物中心提供(合格證號SCXK2006)。海洛因由吉林省公安廳提供,純度為98%,用生理鹽水配制后抽濾除菌。單磷酸腺苷(AMP)及單磷酸鳥苷(GMP)為Amersco產品。Trisol RNA提取試劑盒(Gibco公司)、PrimeScript RT Reagents Kit和SYBR PrimeScript RT-PCR kit(TaKaRa公司)、實時熒光定量PCR儀(ABI Prism 7000型,USA)。

1.2 動物分組及處理 50只大鼠隨機分為5組:①對照組:每日兩次腹腔注射生理鹽水,注射體積及時間與海洛因組相同,第10天處死。②海洛因組:建立海洛因依賴大鼠模型,第1-9天每日兩次腹腔注射海洛因,每日次劑量依次為 0.50、0.75、1.25、2.00、3.00、4.25、5.75、5.75、5.75 mg·kg-1體重 。 ③海洛因+AMP+GMP組:海洛因給藥同第2組,并且每日兩次腹腔注射核苷酸(AMP與GMP等摩爾混合),每日次劑量均為 7.5 mg·kg-1體重。④海洛因+AMP組:海洛因給藥同第2組,并且每日兩次腹腔注射AMP,每日次劑量均為7.5 mg·kg-1體重。⑤海洛因+GMP組:海洛因給藥同第2組,并且每日兩次腹腔注射GMP,每日次劑量均為7.5mg·kg-1體重。各組大鼠于d 10麻醉、處死后,迅速取大腦皮質,立即放入液氮中2 h,然后轉入到-86℃超低溫冰箱內。

1.3 引設物計 所有引物(見表1)均用引物設計軟件PrimerPrimer 5.0設計,由南京金斯特公司合成。

Table 1 Sequences of oligonucleotides used as primers

1.4 RNA抽提 根據Trisol RNA提取試劑盒的操作步驟提取大腦皮質總RNA,核酸測定儀測A260/A280,要求在1.8-2.0之間。逆轉錄反應獲得的cDNA-20℃保存。

1.5 SYBR熒光實時定量PCR 參照說明書設定PCR程序;熔解曲線程序:95℃1 min,65℃15 s,65℃10 s,從65℃緩慢升溫至95℃,每升高0.5℃檢測一次熒光信號值。反應結束儀器自動生成Ct(threshold cycles)值及熔解曲線圖。每個樣本設3個重復管,同時設無模板陰性對照。

1.6 統計學分析 各靶基因mRNA相對表達量采用Pfaffl[5]法進行分析,將同一樣本中目的基因的Ct值與內參基因的Ct值相減,所得出的Δ Ct為目的基因相對于內參基因的表達強度,即Δ Ct=目的基因Ct-內參基因Ct。再使用 2-ΔΔCt方法將目的基因的表達差異通過處理樣本相對于未處理樣本的倍數來表示 ,-Δ Δ Ct=-(Δ Ct實驗組 -Δ Ct對照組)。2-ΔΔCt＞1,目的基因表達上調,反之下調。數據用±s表示,各組均數之間比較采用SPSS11.0統計軟件進行t檢驗。

2 結果

實時定量熒光PCR檢測顯示,海洛因組ADA、黃嘌呤氧化酶(XO)的mRNA比對照組明顯升高,分別為對照組的3.3倍和2.7倍(P＜0.05),而海洛因+AMP+GMP組、海洛因+AMP組、海洛因+GMP組與海洛因組相比明顯降低(P＜0.05)。海洛因組次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)、腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(APRT)和腺苷激酶(AK)的mRNA比對照組明顯降低,分別為對照組的18%,43%和33%(P＜0.05),而海洛因+AMP+GMP組、海洛因+AMP組、海洛因+GMP組與海洛因組相比有不同程度升高,以HGPRT的升高程度尤為顯著(P＜0.05)。海洛因+AMP+GMP組、海洛因+AMP組、海洛因+GMP組的各項指標差異無顯著性,見圖1。

3 討論

圖1 大鼠腦組織中APA、XO、AK、APRT、HGPRT相對表達水平

本實驗采用SYBR Green I熒光實時定量RTPCR法檢測ADA,XO,AK,APRT,HGPRT mRNA的表達,以探討外源性補償嘌呤核苷酸對海洛因所致的嘌呤核苷酸分解代謝增強、合成代謝減弱是否有改善作用。該方法在應用過程中需結合熔解曲線分析來確定PCR產物的特異性[6]。本實驗通過熔解曲線分析,確定PCR反應特異性好,反應過程中熒光信號可反映擴增產物含量的實時變化。結果分析采用相對定量Pfaffl法,首先通過構建目的基因與內參基因β-actin的標準曲線對五種基因擴增效率進行檢測,在此基礎上,用β-actin對各組RNA作均一化處理,計算各實驗組相對于空白對照組的各目的基因mRNA表達的差異倍數。

腺嘌呤核苷脫氨酶(ADA)和黃嘌呤氧化酶(XO)是嘌呤核苷酸分解代謝的關鍵酶,ADA催化腺嘌呤核苷酸轉化為次黃嘌呤核苷酸,進而分解成次黃嘌呤;XO催化次黃嘌呤轉化為黃嘌呤,再催化黃嘌呤分解為尿酸。因此,ADA和XO的活性可衡量嘌呤核苷酸分解代謝狀況。本實驗中海洛因組腦皮質中ADA和XO mRNA水平顯著高于對照組,海洛因+AMP+GMP組ADA和XO mRNA水平雖明顯高于對照組,但比海洛因組有大幅度的降低,說明海洛因促進皮質ADA和XO mRNA的表達,而同時補償嘌呤核苷酸可抑制海洛因的作用。

次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)、腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(APRT)和腺苷激酶(AK)是補救合成途徑的關鍵酶。本實驗中海洛因組腦皮質HGPRT,APRT,AK的mRNA的含量均比對照組明顯降低,而海洛因+AMP+GMP組、海洛因+AMP組、海洛因+GMP組HGPRT,APRT,AK的mRNA的含量比海洛因組明顯升高,與對照組水平相近,說明海洛因抑制腦皮質HGPRT,APRT,AK mRNA的表達,該作用可被同時補償嘌呤核苷酸抑制。

海洛因+AMP組、海洛因+GMP組與海洛因+AMP+GMP組相比,各目的基因mRNA表達量均無顯著性差異,這與體內嘌呤核苷酸的相互轉變有關。單純補充AMP或GMP與同時補充AMP和GMP相比,對海洛因依賴大鼠各目的基因mRNA表達量的影響無明顯差異。

綜上所述,海洛因給藥可以使大腦皮質ADA及XO mRNA表達增強,HGPRT、APRT和AK mRNA表達降低,提示海洛因在基因水平上促進嘌呤核苷酸分解代謝,降低合成代謝,而補償嘌呤核苷酸可抑制上述作用。嘌呤核苷酸因其所表現出來的對海洛因的拮抗作用有望成為治療海洛因依賴的工具。

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