Survivin-siRNA對裸鼠視網膜母細胞瘤移植瘤的抑制研究

吳 荒,孫 瑩,張小猛,劉喜春,張 靈,吳雅臻*

(1.吉林大學第二醫院,吉林長春130041;2.吉林大學第一醫院;3.吉林大學前列腺疾病防治研究中心)

視網膜母細胞瘤是15歲以下兒童中最常見的原發性眼內惡性腫瘤[1-3]。Survivin屬于凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAP)家族成員。具有控制有絲分裂和對抗細胞凋亡兩種作用[4]。Survivin基因在分化完全的組織中不表達或低表達;在大多數癌癥組織中卻有很強的表達[5]。本研究建立裸鼠視網膜母細胞瘤玻璃體移植瘤模型,采用RNA干涉技術,探討Survivin-siRNA對腫瘤細胞中Survivin表達的抑制以及對腫瘤細胞凋亡的誘導作用。

1 材料和方法

1.1 材料和對象 帶有U6啟動子及GFP的質粒pGCsilencer-U6/Neo/GFP購于上海吉凱化學公司,全長6 380 bp。JM109由吉林大學前列腺疾病防治中心保存。Y79細胞株購于中國科學院上海細胞所細胞庫。裸鼠購自中國醫學科學院實驗動物研究所,4-6周齡,體重18-20 g,飼養于恒定溫度(22-25℃)、恒定濕度(40%-50%)的SPF層流室中,經高壓滅菌的標準飼料和水供動物自由食用。

1.2 構建Survivin-siRNA真核重組質粒[6]根據shRNA的設計原則,針對Survivin mRNA特異的靶序列,合成針對其編碼區394-412位堿基序列寡核苷酸鏈,由上海生物工程技術有限公司合成:shRNASurvivin:5′-GATCCCGCAGTTTGAAGAATTAACCTTCAA GAGAGGTTAATTCTTCAAACTGCTTTTTGGAT-3′(sense strand),5′-AGCTATCCAAAAAGCAGTTTGAAGAATTAA CCTCTCTTGAAGGTTAATTCTTCAAACTGCGG-3′(antisense strand);shRNA-Scramble對照:堿基順序隨機排列,與人類基因的外顯子沒有同源性。合成的DNA在5′端和3′端分別帶有BamHⅠ和HindⅢ酶切位點的一部分。互補寡核苷酸鏈退火后分別與BamHⅠ和HindⅢ線性化的載體相連,構建重組質粒pGCsilencer-U6-siRNA-survivin(以下簡稱Survivin-siRNA)和pGCsilencer-U6-siRNA-Scramble(以下簡稱ScramblesiRNA)。

1.3 裸鼠移植瘤模型建立 Y79細胞培養于含10%胎牛血清的IMDM培養液內,置于含5%CO2,37℃的細胞培養箱。當細胞生長至對數生長期時,離心收集細胞,用Hank液洗滌細胞2次,用不含血清的IMDM培養液懸浮細胞,細胞密度為(4.5-5.5)×107/ml。裸鼠21只,所有實驗眼均選擇右眼,乙醚麻醉,復方托比卡胺滴眼液(美多麗)散瞳。在體式顯微鏡下,將鼠上下眼瞼撥開,可以眼球突出于瞼裂 ,使用5 μ l微量注射器吸取 5 μ l細胞懸液自角鞏膜緣部位刺入玻璃體腔,在玻璃體腔內清晰看到注射器針尖,而后緩緩推注細胞懸液,注射后退針。每天觀察裸鼠各種生活變化,每隔3天采用乙醚麻醉,裂隙燈下觀察玻璃體腔內情況。必要時可用蓋玻片輕壓角膜,即可觀察到后部玻璃體及眼底情況。

1.4 抑瘤實驗設計 將Y79細胞種植至21只裸鼠玻璃體腔內,于注射后9天進行抑瘤實驗。將21只裸鼠隨機分為3組:組1為mock對照組(n=7),注射 10 μ l K-PBS(NaCl 30.8 mmol/L 、KCl 20.7mmol/L、Na2HPO48.1 mmol/L 、KH2PO41.46 mmol/L 、MgCl210 mmol/L溶解于雙蒸水);組2為Scramble對照組(n=7),注射帶有非同源的Scramble-siRNA的重組質粒;組3為Survivin實驗組(n=7),注射特異性Survivin-siRNA重組質粒。質粒注射劑量為10 μ g/只,質粒溶解于K-PBS,定量,調節質粒濃度為1 mg/ml。在注射結束后均于注射局部實行電轉染以提高質粒在瘤體內的轉染效率。將兩根銀電極分別置于內、外眥部位,輕壓即可見眼球突出,此時玻璃體腔內腫瘤位于電極中央。電脈沖治療儀的參數設定:電場強度為500 V/cm,脈沖時值5 μ s,次數 2次,頻率 1 Hz。觀察裸鼠各種生活變化,觀察腫瘤大小變化。在給藥后10天摘除眼球,完整剝離腫瘤,一部分用10%甲醛液固定;另一部分新鮮組織提取總RNA和總蛋白。

1.5 半定量RT-PCR檢測Survivin基因表達 取轉染組織100 mg,用玻璃勻漿器充分勻漿。用Trizol試劑盒提取總RNA,經逆轉錄反應合成cDNA。遵循PCR引物設計原則,根據GeneBank人Survivin基因和β-actin基因cDNA序列分別設計引物并由上海生物工程公司合成。Survivin上游引物:5′-GAATTCA TGGGTGCCCCGACGTTGCC-3′;下游引物 :5′-AGATCTTTCTTCTTATTGTTGGTTTCC-3′,擴增片斷長度為475 bp。PCR擴增反應條件:首先94℃5 min;而后94℃變性30 s,59℃退火45 s,72℃延伸2 min,共30個循環;最后72℃延伸5 min。β-actin作為內參照,其擴增片段長度為630 bp。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析,紫外燈下拍照。

1.6 Western blotting檢測Survivin蛋白表達 對轉染后72 h的組織進行裂解,應用Bio-rad測定蛋白含量。取總蛋白 50 μ g作SDS-PAGE電泳。電泳結束后,將PVDF膜用甲醇平衡30 s,用Blotting buffer將膜、膠及Whatman濾紙浸泡10 min,用電轉儀將蛋白轉移到 PVDF膜上。PVDF膜用 Blocking buffer(5%脫脂奶粉)封閉4℃過夜。按Western blot流程依次加入survivin兔抗人多克隆抗體(1∶100),堿性磷酸酶標記的羊抗兔多克隆二抗(1∶2 000),用顯色液顯色,晾干拍照。

1.7 Survivin及Ki67免疫組化染色 取10%甲醛固定后的組織,石蠟包埋,4 μ m連續切片分別行HE染色和免疫組織化學染色。Survivin免疫組化染色:以在腫瘤細胞胞漿或細胞間質內出現棕黃色顆粒,且著色強度高于背景非特異性染色者判定為陽性。Ki67免疫組化染色:以腫瘤細胞核呈現棕黃色或棕褐色細顆粒為陽性,每張切片觀察3個視野,每個視野連續數出300個細胞,并且計算增殖指數(PI)。PI(%)=陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.8 TUNEL法檢測腫瘤組織凋亡 按TUNEL凋亡檢測試劑盒(北京中山公司)說明書進行操作。石蠟切片做凋亡檢測。細胞核染為棕黃色的即為凋亡細胞。每張切片觀察3個視野,每個視野連續數300個細胞,計數凋亡細胞百分比即為凋亡指數(AI)。AI(%)=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.9 統計學處理 利用SPSS 11.0統計軟件包處理。半定量RT-PCR及Western blot均分別做3次。Ki67免疫組化染色計算增殖指數及TUNEL法計算凋亡指數,每組均隨機選擇3只動物的病理切片,每張切片觀察3個視野,即每組9個數據進行多個樣本間比較的方差分析,具體采用Bonferroni檢驗。

2 結果

2.1 成功構建重組質粒 重組質粒Scramble-siRNA和Survivin-siRNA轉化JM109后,小量提取質粒,分別選取陽性克隆進行測序,結果與所設計的寡核苷酸序列一致,證明真核表達質粒構建成功[6]。

2.2 抑瘤實驗觀察 組1為mock對照組(n=7);組2為Scramble-siRNA對照組(n=7);組3為Survivin-siRNA實驗組(n=7)。組 1、組2、組3腫瘤均繼續生長。但組3腫瘤組織較干燥,眼周新鮮血管組織較少,組1與組2的生長狀況無差別。組3中有一例發生了眼球萎縮,腫瘤消失。

2.3 半定量RT-PCR檢測腫瘤組織Survivin mRNA的表達 運用GIS凝膠分析軟件光密度掃描分析,以mock組Survivin產物與內參β-actin產物的電泳亮度比值定為1,Scramble-siRNA組(0.95±0.03)與mock組無差別(P＞0.05),實驗組(0.27±0.06)亮度明顯減弱(P＜0.01),見圖1。這表明重組質粒SurvivinsiRNA在mRNA水平上抑制了Survivin基因轉錄。

圖1 轉染質粒后Y79移植瘤中Survivin mRNA的半定量RT-PCR分析

2.4 Western blot方法分析Survivin蛋白的表達光密度掃描分析以mock組的Survivin與內參β-actin的雜交帶亮度比值定為1,與mock組和ScramblesiRNA組(0.96±0.03)相比,實驗組(0.30±0.09)細胞的Survivin蛋白表達顯著降低(P＜0.01)(見圖2)。Western blot結果進一步證實了構建的siRNA質粒可在蛋白水平上抑制Survivin表達。

圖2 轉染質粒后Y79移植瘤中Survivin蛋白的Western blot分析

2.5 組織形態學觀察 用蘇木素-伊紅(HE)染色普通光鏡下觀察,實驗組與兩對照組相比,在瘤組織內可見到較多死亡細胞,表現為較多細胞碎片,細胞核固縮碎裂,組織結構消失,呈現無結構嗜伊紅染色區等形態學改變。

2.6 免疫組化染色 Survivin表達的陽性顆粒主要位于腫瘤細胞的胞漿內,也可見于少數細胞核中。Survivin-siRNA組移植瘤組織中Survivin蛋白表達與mock組和Scramble-siRNA組相比明顯下降。

Ki67表達的陽性顆粒主要位于腫瘤細胞的胞核內,Survivin-siRNA組Ki67的表達較對照組下降明顯;增殖指數明顯下降(Mock組:63.67±7.26;Scramble-siRNA組:56.63±6.49;Survivin-siRNA組:8.67±5.24;P＜0.01)。

2.7 TUNEL法檢測腫瘤組織凋亡 Survivin-siRNA組腫瘤組織內可見大量細胞核染為棕黃色的凋亡細胞,對照組可見少許凋亡細胞。治療組凋亡指數明顯高于對照組(Mock組:2.33±1.63;Scramble-siRNA組:3.67±1.75;Survivin-siRNA組:38.17±3.76;P＜0.01)。

3 討論

視網膜母細胞瘤是兒童中最常見的原發性眼內惡性腫瘤,出現首個體征的平均年齡為生后7個月(雙側發病病例)和24個月(單側發病病例)[7]。Survivin屬于凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAP)家族成員,具有控制有絲分裂和對抗細胞凋亡兩種作用。Survivin在正常成人組織中幾乎不表達,但在大多數癌癥組織中都有很強的表達。在癌細胞中,Survivin表達量增加與細胞增殖指數增加[8]、凋亡水平下降[9]、抵抗化療藥物能力增強[10]、腫瘤復發率增加相關[11]。我們在以往的研究中發現,Survivin在視網膜母細胞瘤組織中表達上調[12]。由于視網膜母細胞瘤具有特異的基因缺陷,可以對其進行基因治療。如果采用特定的Survivin分子拮抗劑,抑制腫瘤組織中Survivin的表達,就有可能誘導腫瘤細胞凋亡。

本研究選擇了裸鼠作為荷瘤對象。采用的是經裸鼠角鞏膜緣玻璃體腔內注射種植的方法,此法操作簡便,便于腫瘤觀察。本研究觀察結果顯示,腫瘤在玻璃體腔內生長速度較快:首先在玻璃體腔內較為彌散生長,而后聚集成瘤,1周左右眼球結構明顯破壞,兩周左右腫瘤明顯突出于眼外。

本研究采用RNA干涉技術。在種植后9天,將Survivin-siRNA導入裸鼠視網膜母細胞瘤玻璃體腔移植瘤中,此時腫瘤在眼內已顯著生長,但眼球突出并不明顯。治療時將質粒通過角鞏膜緣直接注射入玻璃體腔腫瘤內部,而后進行電轉染加強轉染效果。給藥后10天摘除眼球,完整剝離腫瘤。一部分新鮮腫瘤組織提取總 RNA和總蛋白,通過 RT-PCR在mRNA水平、Western blot在蛋白水平觀察到SurvivinsiRNA抑制了腫瘤組織中Survivin的表達。另一部分腫瘤組織用10%甲醛液固定,通過Survivin、Ki67免疫組化染色和TUNEL法檢測腫瘤組織凋亡均發現實驗組的凋亡較對照組明顯。本實驗中出現了一個特例,即治療組中有一例在注射質粒后眼球逐漸萎縮,腫瘤消失,全身狀態良好。尚無法證明此例是治療有效的體現,因為視網膜母細胞瘤本身存在自發性消退的現象,推測此例可能與此相關。

本研究結果顯示,將構建的Survivin-siRNA重組質粒轉染入視網膜母細胞瘤裸鼠玻璃體腔移植瘤中,抑制了腫瘤組織中Survivin基因轉錄和蛋白表達,誘導了腫瘤細胞凋亡。本實驗為進一步開展基因治療提供了更為直接的手段,為將來人類對視網膜母細胞瘤的治療提供更多、更有效的選擇。

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