ADMA對人臍靜脈內皮細胞粘附功能影響的體外研究

趙 雷,張吉鳳,趙佳怡,祝金明,李淑梅*

(1.吉林大學第二醫院心血管內科,吉林長春130041;2.吉林再生醫學科學研究所;3.吉化總醫院心血管內科)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是危害人類健康的最常見疾病之一,多項研究證實AS的始動及關鍵環節是內皮細胞的損傷。一氧化氮(NO)是內皮細胞合成的一種重要的血管活性物質,具有舒張血管,減弱氧自由基產生、低密度脂蛋白氧化等抗動脈粥樣硬化(AS)的作用,NO合成障礙勢必促進AS的發生、發展。不對稱二甲基精氨酸(ADMA)是內源性一氧化氮合酶(NOS)的抑制劑,通過影響NO合成而導致血管內皮功能障礙[1],因此與冠心病形成密切相關。本研究觀察了ADMA對人臍靜脈內皮細胞粘附的影響,旨在探討其作為一個新的獨立預測冠心病危險事件的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料

ADMA標準品,純度,99.99%(Sigma公司),M199培養基、胰蛋白酶(Gibico公司),胎牛血清(杭州四季青有限公司)、PE標記小鼠抗人ICAM-1抗體、APC標記小鼠抗人VCAM-1抗體(BD公司),NO檢測試劑盒(南京聚力生物有限公司),其它為市售試劑。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈內皮細胞的培養 用0.1% Ⅱ型膠原酶消化法收集HUVECs,加入含20%胎牛血清的M199培養基在37℃、5%CO2孵箱中培養,待細胞80%融合時用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 實驗分組 將狀態良好的用新鮮培養液培養24 h,再用0.25%胰蛋白酶消化制成單個細胞懸液,以5×104/孔接種到24孔板中,對照組加含0.9%氯化鈉培養液,ADMA組加分別含有5 μ mol/L和10 μ mol/L的培養液。每組設 5復孔,培養 48 h后進行數量和功能測定。

1.2.3 細胞粘附能力的測定 在倒置相差顯微鏡下隨機挑選10個視野(x100倍)計數各組貼壁梭形細胞數后,用0.25%胰蛋白酶消化后制成單個細胞懸液,計數后等量接種到48孔培養板,5%CO2孵箱中培養2 h,洗去各孔未貼壁細胞,倒置相差顯微鏡下隨機挑選10個視野(×100倍)計數各組重貼壁細胞數。

1.2.4 NO含量的測定 采用Griess重氮法反應測定細胞培養上清中NO的濃度。吸取各組每孔培養液100 μ l加入到96孔培養板中,再依次加Griess ReagentⅠ、Ⅱ,混勻,15分鐘后用722分光光度計570 nm處測A值。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞表面粘附分子的表達

分別取1×106各組HUVECs,用 PBS-2%FBS洗 1次,用100 μ l PBS-2%FBS制成單個細胞懸液。分別加入適量PE標記小鼠抗人ICAM-1抗體和APC標記小鼠抗人VCAM-1抗體,室溫避光孵育15 min。各組細胞加入2.5 ml PBS-2%FBS,300 g離心10 min。重懸細胞在250 μ l PBS-2%FBS中于流式細胞儀測定。

1.3 統計學處理 全部數據采用SPSS11.0軟件進行統計學處理。計量資料用±s表示,各組之間的比較采用獨立樣本 t檢驗,P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ADMA對人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)形態和數目的影響

對照組HUVECs在培養48 h后成梭形內皮細胞樣,貼壁良好。ADMA不同劑量組細胞粘附能力明顯降低,細胞形態亦發生改變(見圖1)。與對照組相比,ADMA可明顯降低貼壁細胞的數量,且成劑量依賴性(見表1)。

表1 ADMA對HUVECs粘附細胞數量的影響

2.2 ADMA對HUVECs培養上清中NO含量的影響

與對照組相比,ADMA可明顯降低NO的生成(P＜0.01)。ADMA不同劑量組之間的差異亦有統計學意義(P＜0.05)(見圖1)。

2.3 ADMA對HUVECs粘附分子表達的影響

流式細胞儀檢測結果顯示,ADMA可明顯增強HUVECs細胞表面ICAM-1和VCAM-1的表達。與對照組相比,ADMA各劑量組ICAM-1和VCAM-1分子的表達量均有顯著性差異(P＜0.01),ADMA不同劑量組VACM-1表達量的差異亦有統計學意義(P＜0.05)(見表2)。

圖1 ADMA對細胞培養上清NO含量的影響

表2 ADMA對HUVECs粘附分子表達的影響(%)

3 討論

動脈粥樣硬化是一種多因素所致的動脈血管慢性疾病,集中表現為全身性血管內皮功能障礙、血管內膜慢性炎癥、纖維增生、管腔狹窄及血栓形成等。近來研究表明,伴隨以NO生物利用度降低為主要生化表現的血管內皮功能障礙是促使AS發生的始動因素。ADMA作為內源性NOS的抑制劑,通過減少NO合成導致內皮功能不全,因此ADMA與AS的發病密切相關[2-4]。Rainer等[5]證實高膽固醇血癥家兔的血漿中ADMA濃度明顯升高,而NO的含量明顯降低。Cooke[6]等在對高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化患者的血清檢測中得到相似的結果。本研究結果證實不同劑量ADMA對HUVECs細胞產生的NO有明顯抑制作用,且成劑量依賴性。同時,ADMA可明顯降低HUVECs的數目和粘附性能,并對內皮細胞的形態有所改變。因此可以認為高水平的ADMA濃度是HUVECs功能受損的原因之一。

細胞粘附分子(CAM)是調節細胞與細胞、細胞與細胞外基質間粘附及信號傳到作用的糖蛋白,其如何參與心血管疾病的發生和發展一直是醫學研究的熱點問題[7,8]。有研究證明ICAM-1、VCAM-1是介導白細胞向血管內皮附壁游走和向內膜下浸潤的主要分子之一,在AS形成過程中病變部位血管內皮二者的表達水平與病變的嚴重程度成正比[9]。CAM促進AS形成的機制與其增強循環血中單個核細胞粘附在血管內膜表面并遷移至血管壁,吞噬脂質形成斑塊有關。本研究結果顯示在ADMA的作用下,HUVECs細胞表面ICAM-1和VCAM-1的表達水平明顯增高,提示促進粘附分子的表達可能為ADMA引發AS的機制之一。

AS是多種病因造成的始發于動脈壁內膜的一系列復雜分子和細胞改變的總結果,血管內皮細胞粘附特性的改變在參與AS發生發展的作用仍需從分子水平、基因調控等方面進一步研究闡明。

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