寡核苷酸對脊髓損傷后硫酸軟骨素蛋白聚糖表達(dá)調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究

沈 哲,周文鈺,余 錚

(深圳市第二人民醫(yī)院脊柱外科,廣東深圳518035)

在各種類型的不同腦部和脊髓損傷后,反應(yīng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞和其他非神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生了各種各樣的生長抑制因子,如硫酸角質(zhì)素蛋白聚糖(CSPGs),信號(hào)素3A,ephrins如 EphB2 和 slit等 ,這些因子促進(jìn)了神經(jīng)脊髓疤痕的形成,不利于損傷神經(jīng)的再生修復(fù)[1]。應(yīng)用軟骨素酶ABC分解它們的氨基葡聚糖(GAG)鏈可以增加軸突再生。但是,軟骨素酶ABC不能完全地將GAG鏈從蛋白核心上消化下來,還剩下被稱為“導(dǎo)體棒”的糖類[2,3]。以木糖基轉(zhuǎn)移酶-1(XT-1)的mRNA為靶目標(biāo)的DNA酶可以特異性消化特殊的GAG鏈。相同的DNA酶應(yīng)用在受損的脊髓時(shí)引起損傷部分的GAG鏈的顯著的減少和損傷神經(jīng)核周圍軸突的再生[4,5]。本研究在脊髓損傷部位加入此DNA酶,分析硫酸軟骨素蛋白的表達(dá)與ODN-PSs存在的關(guān)系。為選擇和制造可有效地減少損傷部位GAG鏈的存在和促進(jìn)損傷神經(jīng)核周圍軸突的再生的消化酶提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 寡核苷酸(ODN-PSs)和引物序列 參照文獻(xiàn)[2]報(bào)道,序列為:

XT-1ODN-PSs:TGGGGGGACTTGGGCTAGCTACAACGAGACCTTG。

XT-1control:ACGAGTCAGGAACATCGATCGGGAA GTCCCATGC。

XT1s1:5-CTTCATCCGCCTGGGTCTTCG-3。

XT1as1:5-GTAGTGTGTGAATTCCGCAGTGG-3,擴(kuò)增片斷為316 bp。以上均由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)用鼠 新生SD大鼠,由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 抗體和分生試劑 抗鼠CS-56單克隆抗體,兔抗鼠GFAP抗體和多聚賴氨酸為美國SIGMA公司產(chǎn)品,HRP-羊抗兔和HRP-羊抗鼠IgG(l+H)購于北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司;Trizol試劑為Invitragen產(chǎn)品;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、DL-2000 Marker、瓊脂糖、DEPC均為大連寶生物公司產(chǎn)品。

1.4 脊髓損傷模型制備及實(shí)驗(yàn)分組 正常對照組4只,模型組60只。按照改良AllenWD法[6]制成脊髓損傷模型后,再隨機(jī)分為ODN-PSs XT-1實(shí)驗(yàn)組30只和實(shí)驗(yàn)對照組 30只。將模型組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉后,俯臥位固定在立體定位儀的手術(shù)臺(tái)上,以胸椎7(T7)為中心備皮、常規(guī)碘酒、乙醇消毒,鋪無菌單,沿小鼠后正中線縱行切開背部皮膚及皮下組織,剝離棘突旁肌肉,切除T7棘突及椎板,暴露脊髓硬膜。將打擊器的打擊頭(直徑2 mm)放置于T7處硬膜上,將引導(dǎo)重物下落玻管調(diào)節(jié)至與重錘線平行后,連接打擊頭與打擊器,取10 g重砝碼作為重錘,使從玻璃管頂自然下落,撞擊重物擊打打擊頭,造成脊髓損傷;迅速撤開打擊裝置,逐層縫合切口,術(shù)后每8 h擠尿1次;術(shù)后30分鐘,模型實(shí)驗(yàn)組手術(shù)部位注射ODN-PSs XT-1生理鹽水溶液(50 μ g/kg體重),對照組注射等量生理鹽水,均為2次/日,直到動(dòng)物處死;兩組大鼠分別于傷后1、4、7、10、14d 隨機(jī)抽取 5 只,斷脊柱 ,取損傷段脊髓組織,包括損傷段上下各約0.5 cm,標(biāo)記損傷中心刺激脊髓損傷樣本;其中隨機(jī)取其中兩份樣本,-80℃冰箱內(nèi)保存,用于RT-PCR和CS-56的免疫印跡分析;另外三份樣本放于4%多聚甲醛中固定,用于免疫組化染色分析。用于免疫組化染色分析的脊髓損傷樣本先后經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋,平行脊髓縱軸右向左連續(xù)切片,厚度為4 mm。脫蠟后進(jìn)行HE染色、免疫組化染色、RT-PCR和Western blot。

1.5 HE染色分析

切片在二甲苯中脫蠟20分鐘,移入二甲苯和純酒精(80∶20)混合液中10分鐘左右。加入100%、90%、80%、70%酒精,各級(jí)為 5分鐘。蘇木精染液染色10分鐘。水洗玻片上多余染液,1%鹽酸酒精(70%酒精配制)分色片刻。鏡檢控制,直至細(xì)胞核及核內(nèi)染色質(zhì)清晰為止,約數(shù)10秒鐘。蒸餾水短洗后,加0.5%伊紅染液染色10分鐘。依次經(jīng)70%、80%、90%、100%酒精脫水,各級(jí)為5分鐘。封片顯微鏡下觀察、記錄結(jié)果。

1.5.1 免疫組化染色檢測脊髓組織中的GFAP,CSPGs的表達(dá) 分別滴加兔抗鼠GFAP和CS-56(1∶100)抗體 滴加 FITC-羊抗兔 IgG(1∶500),37℃孵育30分鐘封片。C1Plus共焦激光掃描顯微鏡下觀察結(jié)果拍照。每組隨機(jī)選5張標(biāo)本片,于美國Motic公司Motic ImagesAdvanced 3.1圖象處理系統(tǒng)測定陽性結(jié)構(gòu)熒光顯色密度,并計(jì)數(shù)陽性顆粒數(shù)。

1.6 RT-PCR檢測脊髓組織中的CSPGs和GFAP表達(dá)

參考Goetting[2]方法,取與免疫印跡相同的脊髓標(biāo)本,經(jīng)均勻粉碎后用Trizol溶解,提取制備細(xì)胞總RNA,在完成RT-PCR反應(yīng)。具體操作過程如下:

1.6.1 總RNA制備及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 首先按照Trizol試劑盒說明提取細(xì)胞內(nèi)總RNA,然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄 ,其反應(yīng) 體系為 :dNTPs(10 mmol/L)40 μ l,RNase inhibitor 0.5 μ l,Random primer 0.5 μ l,總 RNA(1 μ g/μ l)2 μ l,點(diǎn)動(dòng)離心,,再加入 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μ l,5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液5.0 μ l,DEPC 水10.5 μ l。稍離心,37℃孵育60 min,90℃孵育5 min后,冰浴迅速冷卻。

1.6.2 RT-PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系為:10×Taq酶 buffer(含 Mg2+)50 μ l,dNTPs(10 mmol/L)2 μ l,上(或下)游引物(10 pmol/l)20 μ l,RT 產(chǎn)物 10 μ l,Taq酶 10 μ l,DEPC 水 37 μ l。 先 94℃預(yù)變性 5 min;然后94℃變性1min,58℃退火1 min,72℃延伸2min。完成35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。

1.6.3 產(chǎn)物分析 取5 μ l PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,加6×樣品緩沖液1 μ l,用含溴化乙啶的1.0%的瓊脂糖凝膠電泳,通過凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照,記錄結(jié)果。

1.7 Western blot檢測脊髓組織中CSPGs的表達(dá)

制備0.5 M pH7.6 Tris-HCl緩沖液及細(xì)胞裂解液。將上述制備的脊髓樣本,分成實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯φ战M和ODN-PSs XT-1治療組,按不同時(shí)間點(diǎn)取樣本,進(jìn)行免疫印跡分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)SCI術(shù)后各時(shí)段,SCI術(shù)后第7天GFAP表達(dá)達(dá)到最高峰,因此選用SCI術(shù)后第7天的脊髓切片標(biāo)本作為進(jìn)一步研究的材料。

2.1 HE染色分析脊髓損傷模型組組織出血、疏松水腫、細(xì)胞空泡變性、部分細(xì)胞細(xì)胞核固縮、神經(jīng)纖維溶解、消失。ODN-PSs XT-1組脊髓組織恢復(fù)最明顯,其組織水腫消失,空泡變性減輕,神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)恢復(fù),結(jié)構(gòu)排列完整(見圖1)。

2.2 脊髓切片CS-56的FITC染色共聚焦顯微鏡觀察損傷7天的結(jié)果為例顯示,ODN-PSs XT-1組密度為45.75±1.750與脊髓損傷模型組89.95±1.659相比CSPGs的表達(dá)明顯降低,二者有顯著性差異。

2.3 脊髓切片GFAP的FITC染色結(jié)果表明在脊髓組織中,星形膠質(zhì)細(xì)胞占多數(shù)。與OND-PSs實(shí)驗(yàn)干預(yù)組相比較,脊髓損傷模型對照組膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量偏多,如圖3所示。

圖1 術(shù)后7天脊髓切片的HE染色生物顯微鏡下結(jié)果

圖2 脊髓切片CS-56的FITC染色共聚焦顯微鏡結(jié)果

2.4 脊髓損傷樣本的GFAP和CSPGs的RT-PCR結(jié)果表明在脊髓組織中,脊髓損傷模型對照組的GFAP和CS-56表達(dá)水平均高于OND-PSs實(shí)驗(yàn)干預(yù)組,條帶密度掃描結(jié)果顯示脊髓損傷模型對照組GFAP基因的表達(dá)量4.358±0.214是OND-PSs XT-1實(shí)驗(yàn)干預(yù)組1.051±0.065的4.18倍,CSPGs對照組表達(dá)量為3.203±0.157是OND-PSs XT-1組 0.825±0.049的3.882倍,P＜0.01具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 脊髓切片GFAP的FITC染色共聚焦顯微鏡結(jié)果

2.5 脊髓損傷樣本的CS-56的Western blot表明在脊髓組織中,CSPSs基因和蛋白的表達(dá)水平均很高。而且脊髓損傷模型對照組的CSPSs基因和蛋白的表達(dá)水平均高于OND-PSs XT-1實(shí)驗(yàn)干預(yù)組,密度比為3.403±0.138;Western blot條帶密度掃描結(jié)果顯示脊髓損傷模型對照組CS-56蛋白的表達(dá)量OND-PSs XT-1實(shí)驗(yàn)干預(yù)組的4.27倍,二者之間有顯著性差異(P＜0.01)如圖6所示。

圖4 脊髓損傷樣本中CSPGs的RT-PCR分析結(jié)果

圖5 脊髓損傷樣本中GFAP的RT-PCR分析結(jié)果

圖6 SCI術(shù)后第7天,脊髓切片的CSPG的Western blot染色條帶結(jié)果

3 討論

本研究的目的是為了驗(yàn)證在脊髓損傷后,表達(dá)增加的帶有PGs的GAG在導(dǎo)致神經(jīng)軸突再生障礙過程中起到關(guān)鍵作用的假說。為了達(dá)到這一目的,我們使用了一種新的DNA酶來分解PGs[7]。實(shí)驗(yàn)成功建立了大鼠脊髓損傷模型,通過鞘內(nèi)注射ONDPSs XT-1以裂解膠質(zhì)癱痕中的GAG鏈,減輕CSPGs對軸突再生的抑制作用盡管我們可以證明在脊髓損傷后CSPGs的減少,但仍然有很高水平的剩余。這可歸因于XT-2的代償反應(yīng)[8]。XT-2是另一種與GAG鏈的合成相關(guān)的酶,它可能與各種類型的細(xì)胞有關(guān)。另一種可能是被刺激表達(dá)增加的PGs的量非常多,因此需要更高濃度的DNA酶[8]。我們在以后的實(shí)驗(yàn)中采用多種方法聯(lián)合應(yīng)用,以期解決該問題,也可能是還存在其它不能被該DNA酶分解的抑制性的成分,增加了它對再生纖維的無反應(yīng)性[9]。值得注意的情況是,在條件培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)CSPGs的表達(dá)量與XT-1ODN-PSs的應(yīng)用有明顯的量效關(guān)系,說明這種合成的酶對神經(jīng)損傷的再生可能有幫助,為脊髓損傷的研究提供重要的工具。

[1]Philips MF Mattiason G Wieloch T,et al.Neuroprotective ang behavioral efficacy of nerve growth factor-transfected hippocampal progenitor cell transplants after experimematic brain injury[J].J Neurosurg,2001,94(5):65.

[2]GRIS P,TIGHE A,LEVIN D,et al.Transcriptional regulation of scar gene expression in primary astrocytes[J].Glia,2007,55(11):1145.

[3]Barritt AW,Davies M,Marchand F,.et al.Chondroitinase ABC promotes sprouting of intact and injured spinal systems after spinal cord injury[J].J Neurosci,2006,26(42):10856.

[4]Chen ZJ,Negra M,Levine A,et al.Oligodendrocyte precursor cells:reactive cells that inhibit axon growth and regeneration[J].J Neurocytol,2002,31(6-7):481.

[5]Bradbury EJ,Moon LDH,Popat RJ,et al.Chondroitinase ABC promotes fundtional recovery after spinal cord injury[J].Nature,2004,416:636.

[6]金 宇,管 力,郭世紱.大鼠脊髓損傷動(dòng)物模型的建立[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2007,11(21):4144.

[7]Goetting C,Kuhn J,Zahn R,et al.Molecular cloning and expression of human UDP-D-xylose:proteoglycan core protein beta-D-xylosyltransferase and its first isofor m XT-I[J].J Mol Biol,2000,304(4):517.

[8]Bundesen LQ,Scheel TA,Bregman BS,et al.Ephrin-B2 and EphB2 regulation of astrocyte-meningeal fibroblast interactions in response to spinal cord lesions in adult rats[J].J Neurosci,2003,23(21):7789.