微衛星不穩定性與卵巢癌的初步研究

冷維春,劉俊寶*,陳 鳳

(1.吉林大學中日聯誼醫院 婦產科,吉林 長春130033;2.吉林大學第一醫院)

微衛星(microsatellite MS),廣泛分布于原核及真核生物基因組的串聯式核苷酸重復序列,具有高度多態性。微衛星不穩定性(microsatellite instability,MSI)是指由于染色體復制錯誤導致重復序列增加或減少表現為腫瘤組織與相應正常組織DNA結構性等位基因的大小發生改變。MSI廣泛存在于各種腫瘤組織,但未見于相應正常組織,因此,它被認為是繼癌基因與抑癌基因之后腫瘤分子生物學研究的新熱點。我們檢測91例卵巢癌及其對照組中微衛星不穩定的發生頻率,探討微衛星不穩定性與卵巢癌的發病關系。

1 材料與方法

1.1 標本與試劑

卵巢癌組:91例均為吉林大學中日聯誼醫院婦科2005-2007年收治的卵巢癌患者,均經手術及術后病理檢查明確診斷為卵巢癌。最低年齡18歲,最高年齡75歲,平均年齡52±14.8歲。對照組:15例同期收治的卵巢良性腫瘤的病人,均無腫瘤及遺傳性疾病。15例正常人血液標本,無腫瘤及遺傳病史。各對照組中年齡經統計學分析差異無顯著性。91例卵巢癌患者Ⅰ期23例,Ⅱ期11例,Ⅲ-Ⅳ期57例。taq酶,dNTP,EB等均購自北京鼎國生物技術有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

樣本蛋白酶K消化,水浴過夜后采取常規酚/氯仿提取法。

1.2.2 引物設計及PCR擴增

設計引物D7S522,擴增長度為217-229 bps;PCR擴增體系包括模板DNA 1 μ l,3'或5'端引物各0.5 μ l,dNTPs 1 μ l,PCR 緩沖液 2.5 μ l,Taq 酶 0.5 μ l,ddH2O 18 μ l,共 25 μ l。

置于PCR儀中:94℃預變性3 min,94℃變性30 s,60℃退火 30 s,72℃延伸30 s,反應進行35個循環,72℃終延伸 10 min。微衛星不穩定性位點的瓊脂糖凝膠電泳鑒定及PAGE-SSCP檢測。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,溴化乙錠染色檢測微衛星不穩定性的發生。與自身外周血循環DNA的PCR擴增產物電泳條帶相比,癌組織DNA微衛星位點等位基因的擴增產物電泳條帶增多或減少則判為MSI。所有陽性及可疑病例均重復進行PCR以及電泳確定。

1.3 統計學處理 應用SPSS15.5統計軟件進行統計分析。計數資料采用 χ2檢驗。

2 結果

卵巢癌組PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳過程中未發現有條帶缺失、條帶增多、條帶遷移位置等特異性改變,見圖1。

圖1 D7S522的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

將PCR產物做變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析對照,發現部分樣本有條帶增多改變,(第1、2、5、6、7、10、11、12電泳道均有條帶增多)結果見圖2。

將PCR產物瓊脂糖凝膠電泳一條帶,聚丙烯凝膠電泳出現多余條帶的進行測序分析,疑有突變樣本基因測序結果登陸Genbank進行Blast比對,Blast比對結果可以發現有五處發生了點突變。第5位核苷酸由C變為缺失,第12位核苷酸由C變為缺失,第164位核苷酸由C變為A,第181位核苷酸由C變為G,第185位核苷酸由A變為G。將所有疑突變樣本進行測序比對,統計得出結論如下:詳見表1、表 2。

圖2 上述PCR產物的相對應的聚丙烯凝膠電泳圖譜

表1 微衛星不穩定性與卵巢癌之間的關系

表2 微衛星不穩定性發生率與卵巢癌之間的關系

3 討論

本研究對卵巢癌患者血循環DNA進行微衛星不穩定的檢測,發現微衛星不穩定性與卵巢癌的病理分期,病理類型有關,微衛星不穩定發生在卵巢惡性腫瘤患者的循環DNA中,而卵巢良性腫瘤和正常人循環DNA中未檢測到MSI發生。馬琳[1]檢測60例原發卵巢惡性腫瘤組織的MSI,發現微衛星DNA序列的不穩定性可能在卵巢惡性腫瘤尤其是特殊類型腫瘤的發生過程中起較為重要的作用,并且與卵巢惡性腫瘤的不良預后有關。這與本研究結果相似。本研究結果顯示,MSI與病理類型有關,主要發生在漿液性囊腺癌中,與卵巢癌的臨床分期有關,提示MSI可能是腫瘤進展的一種表現。

MSI目前認為主要是錯配修復基因的改變[2-4],導致基因組不穩定,最終細胞的突變頻率增加,促發惡性腫瘤的形成。鑒于微衛星作為遺傳標記的優勢及其與特定腫瘤良好的相關性,MSI和雜合性缺失分析已成為分析基因不穩定與腫瘤的關系及尋找新的抑癌基因的重要線索[5-7]。MSI可發生于結腸癌、胃癌、宮頸癌等腫瘤發生的早期階段或癌前病變中,也存在于錯配修復缺陷的尚未癌變的正常組織中。并且MSI與腫瘤的復發相關[8]。微衛星位點多,在基因組中廣泛存在,長度一般較短,易于擴增。近年來對糞便、尿液、痰液、胸腹水、分泌物以及腫瘤病人血漿/血清中DNA分子異常的檢測手段日益完善、可靠。所以,MSI可望成為早期診斷部分腫瘤的分子標志。在腫瘤中,微衛星序列不穩定可用來診斷某些存在錯配修復系統缺陷及具有遺傳性的腫瘤,同時也借助微衛星序列不穩定的檢測來評估腫瘤預后的好壞。

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