白色念珠菌細胞壁不溶性β-葡聚糖抗腫瘤細胞的實驗研究

陶佳 崔進

惡性腫瘤是影響人類身心健康和引起人類疾病死亡的主要原因，目前治療惡性腫瘤的方法有消化道反應、造血功能抑制等明顯毒副作用，令患者痛苦，且治療不徹底，復發率高，因此開發高效低毒的抗腫瘤藥物具有必要性和重要性。白色念珠菌是一種條件致病性真菌［1］，其細胞壁的結構似三明治-內層為葡聚糖(glucan)，外層為甘露聚糖，其中葡聚糖和甘露糖蛋白至少占細胞壁干重的80%［2］，β-葡聚糖是白色念珠菌細胞壁含量最高的多糖。

本研究前期實驗已經成功地從白色念珠菌細胞壁中提取出堿溶性β-葡聚糖(CABBG)、酸溶性β-葡聚糖(CAABG)，并分離出不溶性的β-葡聚糖［3］(CAIBG)，且急性毒性實驗研究結果顯示CAIBG比CAABG、CABBG的安全范圍更大，最值得進一步研究其藥效學作用。

本研究自制CAIBG，體外培養B16惡性黑色素瘤細胞、SGC-7901胃腺癌細胞和SMMC-7721肝癌細胞，觀察并結合MTT法檢測CAIBG對以上幾種腫瘤細胞生長的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 瘤細胞株 SGC-7901胃腺癌株、SMMC-7721肝癌株，由云南省天然藥物藥理重點實驗室提供;B16惡性黑色素瘤株從中國科學院典型培養物保藏中心昆明細胞庫處購買。

1.2 菌株 白色念珠菌-CJ(Candida albicans-CJ)，云南省天然藥物藥理重點實驗室保存菌株。

1.3 藥品與主要試劑 噻唑藍(MTT)為德州德藥制藥有限公司產品;a-淀粉酶為上海博奧生物技術有限公司產品;RPMI1640為GIBO公司產品;胎牛血清為杭州四季青生物公司產品。

1.4 主要儀器 發酵罐(NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC，型號BIOFLO-410);CO2培養箱(日本 Olympus公司，型號BH2);酶聯免疫檢測儀(美國BIO-RAD公司，型號680)。

1.5 白色念珠菌的培養 按方法［4］共收集3000 g白色念珠菌菌體。

1.6 CAIBG的提取 按方法［5］獲得干燥粉末100 mg，放入4℃保存備用。

1.7 自制CAIBG劑型及給藥濃度 用電子天平準確稱取CAIBG粉末，溶于1%吐溫-80溶液中，0.2 μm微孔濾膜過濾后，即配制成不同濃度的溶液。

1.8 采用改良MTT法檢測CAIBG對癌細胞的體外抑制作用:常規培養B16惡性黑色素瘤細胞、SGC-7901胃腺癌細胞和SMMC-7721肝癌細胞至對數生長期后，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，用含10%胎牛血清RPMI1640培養基調整細胞以1×104細胞/孔的密度分別接種于3個96孔板，每孔加細胞懸液90μl，每個濃度設5個復孔，在37℃，100%相對濕度，含5%CO2的培養箱預培養24 h。待細胞貼壁后，分別加入500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5 μg/ml、31.25 μg/ml 的多糖溶液、陰性對照劑生理鹽水和溶劑對照劑吐溫80各10μl。分別置37℃、CO2培養箱培養24 h、48 h、72 h 后，加入MTT(5 mg/mL)10 μl繼續培養，4 h 后加入三聯液 100 μl，過夜，次晨在570 nm波長處用酶標儀測吸光度(A570)值。試驗重復三次，計算各組均值。根據以下公式計算出癌細胞生長抑制率:

癌細胞生長抑制率%=(1-實驗組平均A570值/對照組平均A570值)×100%

數據處理通常以T/C表示，T/C=100×OD值處理組/OD值對照組。通過回歸計算，求出T/C=50%的藥物濃度，即IC50值(半數抑制濃度)

1.9 統計學方法 應用SPSS 13.0統計軟件進行多組間及組內差異χ2檢驗，各組實驗的結果用抑癌率表示。

2 結果

2.1 CAIBG作用后腫瘤細胞的形態學變化(見圖1-圖4)，鏡下觀察:對照組細胞排列密集，細胞呈圓形，大小不一，核分裂相及瘤巨細胞多見。而加有CAIBG的B16惡性黑色素瘤細胞和SCG-7901胃癌細胞，排列稀疏，核分裂相減少，細胞呈多形性改變。CAIBG組和陰性對照組比較，SMMC-7721肝癌細胞形態沒有明顯變化。①B16惡性黑色素瘤細胞;②SCG-7901胃癌細胞。

圖1 陰性對照組48 h

圖2 CAIBG(500 μg/ml)48 h

圖3 陰性對照組48 h

圖4 CAIBG(31.25 μg/ml)48 h

2.2 CAIBG對體外培養B16惡性黑色素瘤細胞的生長抑制作用。

表1 CAIBG對體外培養B16惡性黑色素瘤細胞的生長抑制作用

CAIBG對體外培養的B16惡性黑色素瘤細胞增殖有抑制作用，與陰性組比較均有顯著差異(P＜0.01)。在CAIBG濃度達到 500μg/ml時抑制作用最強，抑制率最高達到42.8%;用軟件計算出CAIBG作用于B16惡性黑色素瘤細胞系的半數抑制濃度(IC50)約為1.51 mg/ml。在各濃度作用點上，CAIBG對腫瘤細胞的抑制作用隨時間延長而趨于明顯(P＜0.05)。在相同時間點上，CAIBG對B16惡性黑色素瘤細胞的抑制作用隨濃度增加而增強。

2.3 CAIBG對體外培養胃癌SCG-7901細胞的生長抑制作用

表2 CAIBG對體外培養胃癌SCG-7901細胞的生長抑制作用

在CAIBG濃度達到31.25 μg/ml時抑制作用最強，抑制率最高達到59.88%;用軟件計算出CAIBG作用于SCG-7901胃癌細胞系的半數抑制濃度(IC50)約為0.43 mg/ml。在各濃度作用點上，CAIBG對腫瘤細胞的抑制作用隨時間延長而趨于明顯(P＜0.05)。在相同時間點上，CAIBG對SCG-7901胃癌細胞的抑制作用隨濃度增加而減弱。

3 討論

白色念珠菌作為一種條件致病真菌，關于它的研究一直以來大多是針對其預防，診斷和治療，研究其細胞壁多糖的在國內外都不多見。以往研究證實不溶性β-葡聚糖具有免疫學活性［5，6］。

本研究為了探討CAIBG的體外抗腫瘤作用，用MTT法檢測各癌細胞株加入不同劑量CAIBG后的生長抑制率。結果證明，在沒有添加任何附加條件的前提下，受CAIBG作用的B16惡性黑色素瘤細胞和SGC-7901胃腺癌細胞，細胞排列稀疏，核分裂相減少，細胞呈多形性改變，與對照組比較細胞增生不活躍，形態學上證實了CAIBG具有體外直接抗腫瘤細胞增殖的作用。

不溶性的β-葡聚糖呈顆粒狀，易與受體結合，能激活相應的信號傳導途徑［7］。本實驗中，不能排除CAIBG直接與腫瘤細胞膜表面的受體結合，從而發揮體外直接抑制腫瘤細胞生長的可能性。許多研究證實了CR3是β-葡聚糖抗腫瘤受體基礎之一。屬于β-葡聚糖受體的CR3有兩個不同配體結合區域:I域作為iC3b的結合部位，與其結合，介導白細胞與NK細胞對iC3b調理的微生物或靶細胞的細胞毒功能;凝集素部位與β-葡聚糖特異性結合，激活巨噬細胞，繼而觸發對iC3b調理的腫瘤細胞的細胞毒反應［8］。Yan等［9］從 CR3受體水平對酵母β-葡聚糖抗腫瘤作用的研究揭示了β-葡聚糖通過作用于CR3受體介導的抗腫瘤效應，β-葡聚糖與CR3的凝集素結合部位結合后使巨噬細胞，NK細胞，中性粒細胞處于預激活狀態，通過iC3b作為樞紐，使效應細胞和靶細胞結合在一起，從而殺傷靶細胞，發揮細胞毒作用。

綜上所述，CAIBG可能通過與腫瘤細胞膜上的受體結合，改變腫瘤細胞的能量轉化或影響其細胞通道的開放而導致細胞代謝障礙，達到直接抑制腫瘤細胞生長的作用。值得進一步研究和探討CAIBG的體內抗腫瘤作用及其機制，以及與化療藥物聯合應用的協同作用，具有廣闊的前景。

［1］陸德源.醫學微生物學.人民衛生出版社，1993:237.

［2］Yadomae T，Ohno N.Structure activity relationship of immunomodulating(1 →3)-β-D glucans.Recent Research Development in Chem＆PharmSciences，1996，5(1):23-33.

［3］袁玲玲，崔進，湯顯斌，等.白念珠菌細胞壁不溶性β-葡聚糖升高小鼠血清IL-1β、TNF-α的研究.現代免疫學，2007，27(5):378-381.

［4］Ishitani K，Suzuki S，Suzuki M.Antitumor activity of polygalactosamine isolated from Paecilomyces sp.I-1 strain.Pharmacobiodyn，1988，11(1):58-65.

［5］Gopal PK，Sullivan PA，ShepHerd MG.Analysis of wall glucans from yeast，hyphal and germ-tube forming cells of Candida albicans.Gen Microbiol，1984，130(12):3295-301.

［6］Abel G，Czop JK，Stimulation of human monocyteβ-glucans receptors by glucan particles induces production of TNF-α and IL-1β.Int Immunopharmacol，1991，14:1363-1373.

［6］陳傳紅.真菌多糖藥理作用研究進展.時珍國醫國藥，2006，17(6):933-934.

［7］LI Min，Chen Qing，Sun Jun-jiang，et al.The effect ofβ-glucan of cell wall from Candida albicans on interleukin-6and interleukin-8production by human peripheral blood mononuclear cells in vitro.J Clin Dermatol，2002，31(6):349-350.

［8］Velasco-Velazquez MA，Barrera D，Gonzalez-Arenas A et al.Macrophage-Mycobacterium tuberculosis interactions role of complement receptor 3.Microb Pathog，2004，35(3):125-131.

［9］Yan J，Vetvicka，Xia Y，et al.β-Glucan，a"Specific"Biologic Response Modifier That Uses Antibodies to Target Tumors for Cytotoxic Recognition by Leukocyte Complement Receptor Type 3(CD11b/CD18). The JoumalofInmunology， 1999，163:3045-3052.